PCR检验中标本的采集、处理及核酸提取方法.ppt

●??? 痰标本 ◆测定结核菌DNA时，由于含有较多的粘蛋白和杂质，要对样本进行预处理，要先用液化剂液化痰液，目的是除去痰中的粘蛋白、胶质，液化时间不可太长；痰标本处理的基本模式有通用模式和简单模式两种。 通用模式： 简单模式：0.1mol/L NaOH、50ug蛋白酶K、0.05%Triton。 50ul-离心-取沉淀-加50ul-30分-10分-Tris-HCL中和-5ul扩增 　　测定非结核菌DNA时，加适量生理盐水充分震荡混匀，自然沉淀后，取上清离心，沉淀用于DNA提取。 　　　痰中有血的标本，必须加红细胞裂解液，离心去除红细胞后再进行以上预处理提取DNA。 ●??棉试子标本 放于适量生理盐水中充分漂洗5-10分钟，形成生理盐水悬液，待大块沉淀物自然下沉后，取上清离心，沉淀用于DNA提取，短期内不提取DNA可保存于-70℃以下。 ? ●?脓液 ◆?用于分枝杆菌DNA测定的标本，粘稠的脓液处理方法同痰标本；水样的脓液直接离心，沉淀用生理盐水洗涤2-3遍后用于DNA的提取。 ◆?用于非分枝杆菌DNA测定的标本，粘稠的脓液需先加适量的生理盐水充分震荡后，静置，取上清立即离心，沉淀用于DNA的提取；水样的脓液直接离心，取沉淀提取DNA。 ●???体液（胸水、腹水、脑脊液、羊水、尿液等） 直接离心，取沉淀用于DNA的提取，血性体液应先加红细胞裂解液破坏红细胞，离心取沉淀提取DNA，沉淀若短期存放可放于-70℃。 乳汁： HBV、HCV、布鲁菌、结核分支杆菌 * * PCR检验中标本的采集、处理及核酸提取方法 烟台山医院 赵善娜 聚合酶链反应（PCR）又称无细胞分子克隆系统或体外酶促基因扩增法，是一种模拟天然DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA或RNA片段的技术。该技术可以将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，大大提高了对DNA分子的分析和检测能力。 任何一种感染性疾病都有它的致病原，都是由病原微生物感染机体引起的，所有生物包括这些病原体都有自己独特的遗传信息即基因，所以如果我们能用PCR实验方法检测到机体内某种病原体遗传物质的存在，就等于确诊了这种疾病。 但由于不同病原体感染机体的方式不同，致病过程不同，病原体存在于机体的部位不同，使得 标本的准确采集变得非常重要。 ??? 标本的 采集 ●标本采集的时间 从病人本身的时间来看，采集血液标本需要空腹，因为脂血会干扰核酸的测定，采集肺结核病人标本，最好是晨起用生理盐水反复漱口后用力咳深部的痰于事先经过灭菌处理的带盖的样品盒，样本要避免混入唾液，其它标本如脑脊液、胸腹水、棉试子、脓液等随时采集随时送检； 从疾病发展的历程来看，疾病的发展大都经历潜伏期、发展期、恢复期或稳定期，在潜伏期或恢复期采集标本有时未必能采集到病原体，从而导致阴性的结果。 如HCV感染机体的窗口期用血清学方法检测为70天，而用PCR方法检测则缩短为11天，也就是说，如果病人感染上HCV病毒，PCR方法基因检测病毒仍然有11天的潜伏期是查不到的，在这段时间采集标本势必会出现假阴性的结果；HCV感染急性期后其RNA病毒可能消失，这时候检测RNA病毒也是阴性的结果。 ●??? 标本采集部位的准备 采集部位的清洁消毒可去除非致病微生物和其它杂质，但应适度，清洁和消毒不够会带进杂物甚至取不到靶微生物，造成结果的假阴性；过度消毒可能又会破坏靶微生物。 例如采集女性宫颈口或男性尿道口分泌物查人乳头瘤病毒DNA，首先要用棉试子将宫颈口或尿道口过多的分泌物轻轻擦拭干净，然后更换棉试子，再次取样才是需要的标本。 ●??? 标本采集的类型 标本采集的类型要根据所检测的病原体而定，不同病原体存在部位不同，采集标本的种类也就不同。 ◆??? 血清/血浆/全血标本 用于某些病原体如乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）和人免疫缺陷病毒（HIV）等的PCR临床测定。这些病毒一旦感染机体后，流通于血液中，并能在血液中相对稳定均匀地分布，因此其在血液中的含量变化可以直接反映出病毒复制地多少。 HBV的定量在临床上主要用于药物的治疗监测，而HCV-RNA的存在是HCV感染的确证标志，因为HCV抗体阳性只能表明机体曾经受到或正在受到HCV病毒的感染，它可在病毒清除后仍长期存在，长者可达数年，它不能作为HCV感染的早期指标，也不能判断机体是否存在病毒血症。 ◆??? 痰标本 常用做结核杆