Real-Time PCR 简介.pptx

PCR Real-Time PCR;主要内容;聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction , PCR);PCR反应的特点;PCR 各组分及其对反应的影响;标准PCR反应体系;三、 DNA聚合酶;四、脱氧核苷三磷酸（dNTP） ;五、Mg2+;六、尿嘧啶糖苷（UNG）酶;UNG酶的好处;临床诊断PCR试剂组分;技术服务部;反应温度（变性、退火、延伸） 反应时间（变性、退火、延伸） 循环次数（PCR效率及产物量）;1、温度 ;2、时间 ;技术服务部;靶序列;靶序列;;Cycle 2;Cycle 3;理论值;30次循环后靶序列扩增的数量;实际值;平台效应产生的因素： 引物二聚体的产生、反应产物、各组分的消耗和变性、引物和已扩增的DNA片段间的竞争等;PCR 常见问题及分析;1、扩增失败;2、拖尾现象;3、非特异条带;4、引物二聚体;5、假阳性;6、假阴性;（3）试剂贮存过久 试剂贮存过久，导致检测敏感性下降，而出现假阴性。;Real Time PCR;实时荧光定量PCR的特点;;常规PCR技术： 对PCR扩增反应的终产物进行定性及定量分析;相同模板在同一台PCR 仪上进行96 次扩增的扩增曲线图终点处检测产物量不恒定；Ct 值则极具重现性;荧光定量PCR化学原理;探针法 ? TaqMan ? TaqMan MGB(minor groove binder) ? 分子信标(Molecular beacons);;;;探针信号= DNA拷贝数;Taqman MGB探针;MGB探针的优点;分子信标法;SYBR Green染料;荧光染料的优势在于它能监测任何dsDNA序列的扩增，不需要探针的设计，使检测方法变得简便，同时也降低了检测的成本。 由于荧光染料能和任何dsDNA结合，因此它也能与非特异的dsDNA（如引物二聚体）结合，使实验容易产生假阳性信号。 引物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲线（melting curve）分析的软件加以解决。;熔解曲线 (Melt curve);高分辨率熔解（High-resolution melting，HRM）;HRM与常规熔解曲线的区别;荧光定量PCR数学原理;PCR曲线有两种表达形式;典型的PCR分4个阶段;基线→阈值→ CT值→[DNA]0;基线→阈值→ CT值→[DNA]0;基线调整规则;基线→阈值→ CT值→[DNA]0;阈值调整规则;基线→阈值→ CT值→[DNA]0;为什么CT值∝[DNA]0 ？;为什么CT值∝[DNA]0 ？;CT值与起始DNA浓度的关系;在以纵坐标为Ct值(特定靶核酸扩增曲线与阈值线相交时的扩增循环数)，横坐标为起始拷贝数的实时荧光定量PCR时，;影??CT 的关键因素;反应液成分的影响;ROX 参比荧光;PCR 效率取决于实验、反应混合液性能和样品质量。一般说来，反应效率在90-110%之间都是可以接受的。;评估实时定量PCR 反应的效果;相关系数R2，它是说明两个数值之间相关程度的统计学术语。;Troubleshooting;反应循环数不够;CT值出现过晚;加样存在误差;PCR效率低于90%(slope -3.6);可能原因;用高浓度样品进行反应时线性混乱;用低浓度样品进行反应时线性混乱，且扩增曲线的荧光强度变弱;重现性差;使用了稀释后长时间放置的样品;NTC或阴性对照可见扩增;引物二聚体的出现。;扩增曲线的荧光信号很弱，或扩增曲线的呈锯齿状;Quencher染料的荧光强度过剩;引物设计不够优化;图例分析;没有标准曲线;; 没有扩增曲线;原因1：PCR参数设置错误 –数据收集步骤只有一个循环，只收集了一个数据点。;技术服务部;扩增曲线断裂或下滑;样品浓度跨度太大;探针部分降解;V形扩增曲线;水平扩增曲线;原因： 反应体系污染、试剂失效； 耗材与仪器不匹配； 仪器长时间未做矫正；;标准曲线相关系数不佳 ;实验开始几个循环扩增曲线不平;个别扩增曲线严重向上或向下倾斜