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SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养的实验研究 第一组： 演讲人： 实验目的： 建立一种简便有效的体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法，研究BMSCs的生物学特性，为后续细胞移植和基因治疗提供理想的种子细胞。 实验结果： 大鼠BMSCs体外培养生长状况良好，可见BMSCs呈均一的梭形和多角形。流式细胞仪检测显示BMSCs表达CD29、CD90，不表达CD34、CD45。经体外诱导后具有多向分化潜能。 试验方法： 全骨髓贴壁培养法分离大鼠BMSCs，体外培养和连续传代，在倒置相差显微镜下连续观察细胞的形态变化，利用MTT法测定其生长曲线，流式细胞仪鉴定其表面抗原，成骨、成脂肪诱导分化鉴定其多向分化潜能。 结论： 全骨髓贴壁培养法适合体外分离、扩增和纯化大鼠BMSCs，培养的大鼠BMSCs具有间充质干细胞的一般生物学特性，为后续基因修饰BMSCs及其体内移植实验奠定良好的基础。 实验材料： 6~8 周龄雄性SD大鼠，体质量80~100 g，清洁级，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[许可证号为SC-XK(沪)20082-005]。胎牛血清(美国Hyclone 公司)，L-DMEM 培养基(美国Gibco公司)，胰酶( 美国Gibco 公司)，CD34-FITC 抗体、CD45-FITC 抗体、CD90-FITC 抗体(英国AbD Serotec公司)，CD29-FITC抗体(美国Biolegend公司) 前言： 骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)作为一种组织特异性干细胞，具有高度增殖能力和多向分化潜能，其作为种子细胞在干细胞移植和基因治疗等方面的研究倍受关注。 2007年9月至2008年8月我们开展了体外分离纯化及培养扩增大鼠BMSCs 的实验，为进行基因修饰BMSCs及其体内移植的后续实验奠定良好的基础。 试验方法：1、鼠原代BMSCs的分离培养 抽取10%水合氯醛0.2 ml腹腔注射麻醉大鼠后，用75%酒精浸泡大鼠双下肢5min，无菌条件下分离出大鼠双侧的股骨和胫骨，将离体的骨干放入灭菌PBS缓冲液中冲洗后转入含10%胎牛血清的低糖型DMEM培养基的培养皿中。剪去两侧干骺端，暴露骨髓腔，用无菌注射器抽取5ml含10%胎牛血清的低糖型DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，直至骨髓腔内所有骨髓液冲净。反复吹打骨髓冲洗液制成单细胞悬液，将此悬液接种于25cm2的塑料培养瓶中，置于37℃、5%二氧化碳的细胞培养箱内培养。3d后首次换液，以后每3d换液1次。倒置显微镜下逐日观察细胞形态。 2、大鼠BMSCs的传代与纯化 通过全骨髓贴壁培养法，每次换液弃除悬浮细胞。贴壁细胞主要是BMSCs，但可能混有淋巴细胞、单核细胞等造血细胞，7~10d原代细胞生长融合达80%~90%，以0.25%乙二胺四乙酸(EDTA)-胰酶消化后按1:2的比例传代培养。原代细胞传代后的细胞标记为P1 (Passage 1)，反复传代扩增，并依次递增标记。每次传代时用0.25% EDTA-胰蛋白酶(0.04 ml/cm2)消化1~2 min，加入含10%胎牛血清的低糖DMEM完全培养基终止消化。严格控制胰酶的用量和消化时间，利用BMSCs较易脱落的特点，保证BMSCs在较短的时间内与培养瓶底分开，淋巴细胞、单核细胞则因贴壁性强仍贴附于培养瓶底，从而使BMSCs得到纯化。 大鼠BMSCs生长曲线测定： 为了定量测定大鼠BMSCs的生长状况，对来源于同一动物的原代细胞进行连续培养，分别选取生长良好的P1、P3、P5代BMSCs消化后制备成细胞悬液，调整细胞密度为5×104/ml。接种于96孔板，每孔接种200 μl 细胞悬液进行培养(每孔1×104细胞)。次日起每天选择6个培养孔各自加入MTT溶液(5 mg/ml)20μl，37℃继续孵育4h后终止培养，吸出孔内上清，每孔加入150μl二甲基亚砜(DMSO)，室温振荡10 min，使结晶充分溶解。与实验孔平行设不加细胞只加培养液的空白对照1孔。在酶标仪上选择570nm波长，以空白孔调零，测定各孔吸光度(A)值，连续测7d，以时间为横轴，A值为纵轴绘制细胞生长曲线。 2、大鼠BMSCs P4细胞成骨、成脂诱导分化鉴定 (1)向成骨细胞诱导分化：待培养的BMSCs P3细胞生长至80%~90%的融合，加入0.25%EDTA-胰酶消化后，以2×104/孔的密度接种于6孔培养板，常规培养1d后，诱导分化培养组(实验组)加入2 ml成骨诱导分化培养液，基础培养组(对照组)加入等量基础培养液，每3d换液1次。成骨诱导21d后，进行茜素红染色检测，确定细胞外基质的矿化。 (2)茜素红染色：两组细胞分别用PBS冲洗2次，95%