《PCR原理与技术》PPT课件.pptx

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《PCR原理与技术》PPT课件

PCR原理与技术;PCR-polymerase chain reaction 聚合酶链式反应,实际上是一种体外的DNA复制技术。因此,它的过程与体内DNA复制有相似之处,只不过在体外就得采取体外的技术方法达到生物体内的效果。 体内DNA复制首先是将双链DNA打开,使用的是解旋酶。PCR技术是通过升高温度变性的方法。 体内DNA复制的引物由RNA聚合酶来完成,PCR是通过降温使人工合成的引物退火。 延伸都是聚合酶发生作用的阶段,只不过体内体外的温度不同。;PCR过程:变性、退火、延伸,此过程循环反应。 变性就是将双链的DNA打开,使其变成单链,以使引物可与其结合(碱基互补配对)。变性的方法就是升高温度到94℃-98℃,温度因酶而异。 退火就是缓慢降低变性温度至引物与模板结合。 延伸就是将温度升到聚合酶活性最佳温度,进行聚合反应。 以上3个过程完成一次为一个循环,一般PCR可以进行25-35次循环。扩增2^25-35倍。;从PCR的过程可知道,PCR反应的进行需要的条件为: DNA聚合酶 模板 引物 原材料和能量——dNTP 反应发生所需要的水盐环境 还有外部环境条件——温度(PCR仪提供) ;94℃ 3min (预变性) 94℃ 30s (变性) 60℃ 30s (退火) 72℃ 1min (延伸) 72℃ 10min (充分延伸) 4℃ hold (可有可无);Taq酶 (有很多种聚合酶) Buffer (反应所需要的缓冲液,含镁离子等) dNTP 模板DNA (来自基因组DNA, 质粒,cDNA等) 引物DNA (公司合成) 无核酸酶的水;(4)dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性;(5) Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降; Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度; (1)变性 使双链DNA解链为单链 94℃ 20-30秒 (2)退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。 ;(3)延伸 70-75℃,一般为72℃ 延伸时间由扩增片段长度决定 (4)循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多:扩增效率降低 错误掺入率增加 ; ;引物设计原则;引物设计常用资源;普通PCR 反转录PCR(rt-PCR) 巢式PCR 反向PCR 不对称PCR 实时PCR(real-time PCR,RT-PCR) /p-081712353458.html;反转录PCR是一种将逆转录和PCR技术偶联起来,检测基因表达的转录水平的一种技术。 它是先利用逆转录酶将RNA转录成cDNA,然后以cDNA为模板做PCR。 常用的逆转录酶有:鸟成髓细胞瘤病毒来源的AMV、Moloney 鼠白血病病毒来源的M-MLV rt-PCR有一步法和两步法两种。 ;18;逆转录;20;总 RNA 提取步骤(以细胞为例) 1、将细胞(六孔板、6cm培养皿)用冷PBS洗一遍,弃去PBS 2 、向培养皿中加1ml Trizol,反复吹打,并转移至1.5ml RNAse free的EP管中,室温放置5min,使细胞完全裂解 3 、加入200ul 氯仿,剧烈摇晃15s,12000rpm离心15min,4℃ 4、转移上清500ul至一个新的1.5ml RNAse free EP管中 5、加入500ul 异丙醇,充分混合,室温放置10min,12000rpm离心10min,4 ℃;6、弃去上清液,此时可见白色RNA沉淀 7、加入1ml 75%乙醇,轻轻洗沉淀,12000rpm离心5min,4 ℃ 8、小心弃去液体,开盖放置EP管,等待沉淀完全干燥 9、加入30~100ul RNAse free H2O,溶解RNA 10 、将EP管放置60 ℃加热器中10min,助溶RNA 11 、定量 12、 -80 ℃ 保存;RNA质量的鉴定;24;RT-PCR; 普通PCR :终点定量,结果不稳定,反应环境、循环次数对结果影响较大,不能定量起始DNA模板数量。 Real-time PCR : 灵敏

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