抗生素备课 第六章 种子制备和菌种保藏.ppt

第六章 种子制备和菌种保藏 第一节 概述 一、种子制备 种子制备是抗生素发酵生产的第一道工序。 种子制备：利用生产菌种，在一定的条件下，经过扩大繁殖，成为具有一定质量和数量的纯种，供给抗生素生产使用。 二、菌种保藏 为了保持菌种的优良性能和菌种生产能力，需要对菌种进行妥善保藏。 第二节 种子制备 包括两个过程： 1、孢子制备：生产大量孢子 2、摇瓶种子制备：生产大量种子菌丝 又可分为：实验室制备阶段与生产车间制备阶段 一、孢子制备 （1）不同菌种孢子制备工艺 a 、放线菌类：孢子培养多数采用人工合成琼脂培养基，其中C、N源不需太丰富，N源相对C源要少一些，避免菌丝大量形成，以利于大量产生孢子。 培养温度：28℃ ，部分为30℃ 或37℃ 。 培养时间：因菌种不同而异，一般4-7 天，也有14天。 孢子成熟后，于5℃ 冰箱保存备用。 存放时间：一般1 周内，少数可存放1~3 月。 b 、霉菌：孢子培养多数采用大米、小米、麦麸等天然培养基。首先将保存在冷冻管或沙土管中的孢子接种在斜面上恒温培养，待孢子成熟后制成孢子悬浮液，然后接种到大米或小米培养基，培养成熟后成为“亲米” ，由“亲米”再转接到大米或小米培养基上，培养成熟后成为“生产米”。用“生产米”接入种子罐内。 培养温度：25-28℃ 培养时间：4-14 天 制备好的大米或小米孢子，于5℃ 冰箱保存备用，或将大米或小米孢子中水分用抽真空至含水量10%以下保存备用。 c 、细菌类 在斜面上培养 培养温度：37 ℃ 时间时间：多为1~2天，产芽孢5~6 （2）影响孢子质量的因素及其控制 a 原材料质量影响（产地、品种、加工方法、成分用量等） b 培养条件影响（如温度、相对湿度） c 冷藏时间影响 d 孢子龄及接种量的影响 二、摇瓶种子制备 一般孢子制备好后，直接进罐培养，这样工艺路线较短，易控制。 但针对某些微生物菌种的孢子发芽和菌丝繁殖速度较缓慢 ，为了缩短种子罐培养周期和稳定种子质量，可将孢子经摇瓶培养成菌丝后再进罐。这就是摇瓶种子。 三、种子罐种子制备 孢子悬浮液或摇瓶种子接入种子罐后，在罐中繁殖成为大量菌丝过程，从而缩短发酵罐繁殖菌丝的时间，增加合成抗生素时间。 生产车间制备种子时应考虑以下几点： 1、种子罐级数的确定 种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数。 种子罐级数确定根据：（1）菌种生长特性（2）孢子数量（3）孢子发芽及菌丝繁殖速度（4）发酵罐的容积 二级发酵，即一级种子扩大培养，如青霉素，四环素； 三级发酵，即二级种子扩大培养，如红霉素、庆大霉素； 四级发酵，即三级种子扩大培养，如链霉素。 种子级数愈少，愈有利于简化工艺和控制，并减少了因多次接种而产生污染的机会。 2、接种龄 指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐的培养时间。 接种龄以菌丝处于生命力极为旺盛的对数生长期，且培养液中菌体量还未达到最高峰时为宜。 3、接种量 指移入的种子液体积与接种后培养液体积比例。最适接种量为7~15%。 4、培养条件 良好的培养条件，如培养基的营养成分应完备齐全，较易利用，N源丰富，P含量比发酵配方高，糖略低。培养过程中通气搅拌、溶氧控制均很重要。 第三节 菌种保藏 一、目的 （1）保持菌种活力 （2）保持菌种优良特性 二、原理 根据菌种的生理、生化特点，创造条件使菌的代谢活动处于不活泼的状态。 保藏时（1）挑选优良的纯种，一般挑选休眠体，如孢子，芽孢等。（2）然后创造一个最有利的环境条件，如低温，干燥，缺氧和缺乏营养物质等。 好的保存方法：较长期地保存菌种优良特性 方法要经济简便 三、方法 （一）定期移植保藏 1、原理 造成低温环境，降低菌种新陈代谢活动能力，从而使菌种的特性在一定时间内基本保持稳定 2、方法将健壮的菌种于5 ℃，70%湿度下保藏。每间隔一定时间重新培养一次。 3、优缺点 （二）液体石蜡封藏法 在长好菌的斜面试管中，加入灭过菌的液体石蜡，可防止培养基内水分蒸发，隔绝培养物与氧的接触，从而降低微生物的代谢活动，推迟细胞老化，延长保存时间。 （三）真空冷冻干燥保藏 1、原理 在较低的温度下，即-15 ℃以下，快速将细胞冻结，并且利用保护剂保持细胞完整，然 后在真空中使水分升华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异。因此微生物一般可保存5年左右。 2、方法 先将微生物制成悬浮液，再与保护剂（如脱脂牛奶）混合，然后放在安瓿管内，低温下使其迅速冻结，并在低温下用真空泵抽干，最后将安瓿管熔封，并低温保藏。 保护剂：一般采用脱脂牛奶或血清。在冷冻干燥的脱水过程中代替结合水而稳定细胞膜的构型，防止细胞膜因为冻结而破坏。 3、优缺点 保存效果好，不易发生变异，因此菌种可保持很长时间