《抗体制药》ppt课件.ppt

体外免疫法：用4～8周龄BALB/c小鼠的脾脏制成单细胞悬液，再加入适当抗原使其浓度达0.5～5μg/ml,在5% CO　37 C 下培养4～5天,再分离脾细胞,进行细胞融合。 o 2 o 二、细胞融合与杂交瘤细胞的 选择性培养 1.骨髓瘤细胞的选择 应尽可能选择自身不合成或至少不分泌任何免疫球蛋白分子或片段的骨髓瘤细胞作为亲本细胞。 细胞必须处于良好的生长状态，对数生长期最好。 2.免疫脾细胞悬液的制备 取经免疫的小鼠，摘除眼球放血，将小鼠处死，无菌摘取脾脏，研磨制取脾淋巴细胞悬液，洗涤调整细胞浓度。 3.细胞融合的方法： 脾细胞（1×108）与骨髓瘤细胞（2×107）混合，聚乙二醇（ PEG）诱导下融合，2分钟，然后用培养液将融合液缓慢稀释。 PEG相对分子量4000，浓度为50%，DMSO（二甲基亚砜）增加融合率，时间不宜过长。 细胞融合后可产生多种融合： 　 脾—脾、脾—瘤、瘤—瘤融合细胞； 还有为融合的脾细胞和为融合的瘤细胞。 选择性培养: 培养基 为HAT培养液。 次黄嘌呤(H)、氨甲喋呤(A)、胸腺嘧啶(T)配制而成。 A阻断DNA合成。 脾细胞在一般情况下不能连续培养。 骨髓瘤细胞都是HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）缺乏株，不能利用H和T合成DNA,而脾细胞中有这种酶，所以只有脾—瘤才能在HAT选择培养基上生长。 三、筛选阳性克隆与克隆化 筛选阳性克隆常用检测方法： 1、免疫酶技术 2、免疫荧光技术 3、放射免疫技术 应根据实验室条件及抗原的情况选择合适的方法。 ELISA原理 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。 结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原?或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。 在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用?洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上?。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物?质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很?高的敏感度。 ELISA用于破伤风抗体的筛选 克隆化是指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。这种群体细胞的生物学特性和功能完全相同。 常用方法：有限稀释法和软琼脂培养法 四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定 1. 杂交瘤细胞鉴定： 染色体分析、抗体稳定性分析、外原因子检查。 2. 单抗进行Ig类和亚类鉴定： 用羊或兔抗Ig不同类或亚类抗体，进行免疫扩散或ELISA鉴定。 3. 亲和力 常用方法：相对亲和力测定 4. 纯度含量测定 纯度一般用层析法测定 5. 活性测定 测效价 6. 识别抗原位点测定 7. 特异性、交叉反应性测定 五、单克隆抗体的大量制备 目前制备的方法主要有两种：动物体内诱生法和体外培养法 1.体内诱生法：可获的5～20mg/ml抗体，用BALB/c小鼠。 降植烷 接种杂交瘤细胞 取腹水 离心 上清。 2.体外培养法 目前工业化生产常用方法， 体外培养法可获的10μg/ml抗体。 动物细胞培养技术发展非常迅速，越来越多用于单克隆抗体的生产。 六、单克隆抗体的纯化 依单抗IgG类和亚类不同，选各种不同的纯化方法。体内诱生法单克隆抗体的纯化方法： 1、离心，取上清，超滤，盐析。 2、分离 ：⑴凝胶过滤用于IgG IgM单抗纯化。⑵阴离子交换层析IgG单抗纯化。⑶亲和层析 IgG单抗纯化。 第三节 抗体诊断试剂 一、血清学鉴定用的抗体类试剂 ⒈鉴定病原菌的抗体试剂 ⑴常用诊断血清的品种和用途 ①沙门氏菌属诊断血清 ②志贺氏菌属诊断血清 ③病原性大肠埃希氏菌诊断血清 ⑵诊断血清的制备步骤 　①制备细菌抗原 　②免疫动物和制备抗体血清 ⑶诊断血清诊断方法 ⒉乙型肝炎病毒表面抗原的反向被动血凝诊断试剂 ⒊妊娠诊断试剂 ⒋抗ABO血型系统血清 若将血型不相容的两个人的血滴放在玻片上混合，其中的红细胞即聚集成簇，这种相容称为凝集（agglu