乙肝病毒耐基因测序.ppt

乙肝病毒耐药基因测序的临床应用 ◆DNA测序技术原理 ◆乙肝耐药基因测序特点 ◆耐药基因测序的应用 DNA测序技术原理 乙肝病毒结构 本实验采用核酸扩增技术结合荧光标记探针杂交方法对乙型肝炎病毒DNA进行定量检测，其产物经过测序PCR反应，产物纯化后上3130测序仪进行毛细管电泳，得到测序峰图，从而完成耐药突变位点的检测。 HBV DNA 的提取 定量PCR反应 （ HBV DNA ≥ 5×103 IU/ml 的标本可以进行测序） PCR产物的酶解（SAP酶混合物） 测序PCR反应 （双脱氧终止法） 测序产物纯化 （乙醇纯化法） 上机测序 （毛细管电泳） 测序峰图分析 双脱氧终止法原理 病毒DNA定量分析得到HBV DNA ≥ 5×103 IU/ml 的标本可以进行后续的耐药基因测序 ，定量PCR产物经过SAP MIX的纯化后，进行测序PCR反应。 普通PCR与测序PCR反应的比较 SAP MIX的作用 外切酶Exon I 降解定量PCR产物中残留的单链PCR引物。SAP酶除去定量PCR产物中残存的脱氧核苷三磷酸的磷酸基团，从而达到纯化定量PCR产物的目的。 经过SAP MIX 酶解纯化后的定量产物方可以进行后面的测序PCR反应。 测序PCR循环条件 96℃ 1min → (96℃ 10sec , 50℃ 5sec , 60℃ 4min) ×25 cycles →4℃恒温。 60℃ 4min的延伸时间是与普通PCR最大差别，目的是为了扩增出一系列相差一个碱基的ddNTP末端终止的DNA序列。 测序反应得到的产物经过酒精纯化，甲酰胺变性之后，可以上机进行毛细管电泳。 酒精纯化的目的是去除未结合的荧光染料终止物和残留的引物、盐离子、酶等。此步对测序成功非常关键，关系到测序峰图质量的好坏。 毛细管电泳原理 一、电进样与电泳 毛细管和电极深入样品溶液中，加电压，荷负电的DNA分子进入毛细管，在电场作用下向阳极泳动。 二、荧光激发和检测 带4色荧光标记的DNA片段按分子量从小到大依次经过激光检测区，激光激发荧光，产生长波长的荧光信号，荧光信号被CCD收集，软件将光学信号转换成电泳图谱。 HBV野生型质控的测序峰图 耐药突变位点命名 命名体系将HBV聚合酶蛋白划分成4个区域：终蛋白区、间蛋白区、rt区和RNA酶区，每个区的氨基酸分别计算位码。rt区起始于高度保守的EDWGPC DEHG位点，包含344个氨基酸，拉米夫定治疗相关的变异主要发生在该区，包括rtL180M和rtM204V/I等。新命名体系包括4个部分，即所属区域、治疗前氨基酸、变异位码和变异氨基酸，如rtL180M表示变异发生在rt区的180位点，亮氨酸（L）被蛋氨酸（M）所取代。应当指出的是，发生变异不一定耐药，只有当变异株成为优势株时才发生耐药。 本资料来源于 网址：/Article/ygfz/ygzl/200211/1159.html 上海申友乙肝病毒DNA测序试剂盒检测的 耐药位点 复制DNA序列于NCBI基因分型网页上，就可得到乙肝病毒基因分型结果。 /projects/genotyping/formpage.cgi 乙肝耐药基因测序特点 基因芯片和基因测序方法检测乙肝耐药位点的比较 相较于基因芯片检测，基因测序法具有直观，准确的优点，也避免了DNA杂交可能发生的污染，假阴性，假阳性问题。对于杂合子，也就是野生型与突变型共存的状况，更直观可靠。 乙肝病毒耐药位点检测的临床应用 HBV拉米夫定耐药 HBV阿德福韦耐药 阿德福韦为5’-单磷酸脱氧阿糖腺苷类似物，可明显抑制HBV DNA复制 HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者，1、2、3年时的耐药发生率分别为0%、1.6%、3.1% HBeAg阴性者1、2、3年的耐药发生率分别为0%、3.0%、5.9%~11% HBV恩替卡韦耐药 拉米夫定耐药的病毒株对恩替卡韦敏感性降低8至30倍； 发生YMDD变异患者治疗1 年时对恩替卡韦耐药发生率为5.8%，并出现相关的位点变异。 乙肝治疗的耐药管理 耐药也是一个“进化升级”的过程，从初级的“基因变异”，逐渐演变成中级的“病毒学耐药”，最终修炼成了的“临床耐药”。 “基因耐药”是指在抗病毒治疗过程中体内乙肝病毒基因组产生了变异，形成新的耐药性病毒基因序列。在这个初级阶段，变异病毒株在人体内的含量很少，还属于毫不