体内药物分析方法方法的设计与评价.ppt

②粪和尿：大鼠粪便样品于室温风干称重后，置乳钵内研成细末，用生理盐水按10％稀释使其成混悬液。取混悬液0.5mL或尿样0.5mL用乙酸乙酯4.0mL提取两次，合并两次提取液，于50℃水浴用氮气吹干，加入甲醇1.0 mL，振荡溶解后进样10 uL。 ③组织匀浆：将大鼠断头处死，取心、肝、脾、肺、肾、胃、肌肉、脑、睾丸各组织，称重，用组织匀浆器制成生理盐水匀浆，使每mL含各组织0.4g，取此匀浆0.2mL，按血浆样品处理方法进行处理分析。 2．结果与讨论 (1)色谱行为 在上述色谱条件下，淫羊藿苷(icariin，ICA)与内标、淫羊藿提取液中的其他6种成分及血浆内源性物质得到良好分离(见图4-1)，ICA及内标苯甲酸的保留时间分别为7.92min和11.93min。 (2)标准曲线的制备 用甲醇精密配制成1mg/mL ICA标准贮备液，再用甲醇稀释成100ug/mL标准工作液，置冰箱保存。另用甲醇制成1mg/mL内标贮备液，再用甲醇稀释成40ug/mL标准工作液，置冰箱保存。用ICA标准工作液及空白生物样品配制标准系列，按样品预处理方法操作，以ICA与IS峰高比为纵坐标，ICA浓度为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数。 由于粪和尿中的代谢产物干扰内标色谱峰，因此粪和尿采用外标法、以ICA峰高为纵坐标，ICA浓度为横坐标绘制标准曲线。结果血浆、尿、组织匀浆和粪的线性范围分别为：1～128，2～32，2～32，4～64ug/mL。血浆的标准曲线方程(n＝6)为： 其他生物样品标准曲线方程的r值均大于0.99。 (3)回收率 分别于空白血浆中准确加入一定量的ICA标准工作液，按上述方法经提取后进行HPLC分析，按血浆标准曲线方程测得浓度，求出方法回收率。标准品经提取后，与标准品直接进样测定所得各对应标准品与内标峰高比值相比较，求得血浆样品的提取回收率，见表4-1。 其他生物样品的方法回收率均大于95.26％，提取回收率均大于73.57％。 (4)精密度 用空白血浆制成含ICA 2，8，32，128 ug/mL样品溶液各5管，测定日内及日间误差，结果见表4-1。其他生物样品的日内、日间相对标准偏差(RSD)均小于7.1％。 (5)灵敏度测定 按色谱峰信噪比(S/N)为3作为检测下限，结果显示ICA的最低检测浓度为0.5ug/mL。 (6)色谱分析条件选择 淫羊藿提取液中的主要化学成分为淫羊藿苷，还有其他黄酮类化合物存在，因此在上述色谱条件下可出现6～7个蜂。为了获得最佳分离效果，首先用甲醇:水为流动相进行分离，当比例为55:45时，虽然ICA与其他化学成分已分离，但其保留时间较长，峰形较宽，且柱压较高。为此，选用对黄酮类化合物分离选择性较好的四氢呋喃，并加入一定量的冰醋酸，使弱酸化合物分离效果更佳。经过调整不同比例，多次试验，最后确定四氢呋喃:水:冰醋酸最佳配比为20:75:5。 (7)内标选择 为能用内标法准确测定ICA浓度，本文对槲皮素、芦丁、橙皮苷、氨茶碱、阿斯匹林、非那西汀、黄体酮、苯甲酸和兰萼甲素等13种药物进行了测定，考察其与ICA在血浆中的分离情况，结果用保留时间小于ICA的药物作内标时，往往被血浆中干扰峰所干扰。阿斯匹林、非那西汀均在ICA前1～5min出峰，却被淫羊藿提取液中其他成分所干扰。兰萼甲素和苯甲酸均在ICA后2～4min出峰，没有任何峰干扰，因此两者均可作为内标，考虑到苯甲酸方便易得，故选用苯甲酸作为内标。 (8)提取溶媒的选择 本文考察了用乙醇、乙酸乙酯及乙醇:乙酸乙酯(1:5)为溶媒对ICA进行提取测定，发现前者提取回收率小于60％，而后者虽然提取回收率大于95％，但带入杂质峰较多，而且色谱系统稳定性下降。因此实验选用乙酸乙酯为提取溶媒，各生物样品的提取回收率均大于73％，且方法稳定。 (9)药物在生物样品中的稳定性 于各空白样品中加入ICA标准品，配制成15ug/mL浓度的样品数份，置-20℃冰箱保存，分别于第0、5、15、30 d按实验方法测定，RSD均小于7.1％。说明该药物在各生物样品中-20℃冰箱保存下，至少可稳定1个月。 (10)血药浓度的测定 为了检验上述方法是否能满足ICA的药代动力学研究，应用本方法进行了大鼠静脉注射淫羊藿提取液。由大鼠颈静脉按10mg/kg静脉注射，于给药后5，10，15，20，25，30，40，60，80，120，180 min于颈静脉各取血0.25mL，肝素抗凝，离心后取血浆0.1mL，按上述方法提取和测定ICA浓度，以给药时间为横坐标，血浆中ICA的对数浓度为纵坐标绘制药时曲线，见图4-2。 血药浓度测定结果表明，本文建立的分析方法可满足ICA药代动力学研究的需要，具有灵敏度高、准确性好等优点。 例2：用RP-HPLC法同