利用Invitrogens Gateway 技术发新的研究丝状真菌功能基因组的工具.ppt

读书报告 刘 佳 生物化学与分子生物学 学号：2110805025 2009年1月8号 Development of new tools for studying gene function in fungi based on the Gateway system 1. Introduction 在早期阶段通过高通量的方法来研究丝状真菌的功能基因组，不像啤酒酵母，大多数的丝状真菌显示低频率的同源重组。通过基因敲除来研究丝状真菌的基因功能，由于技术挑战需要产生与同源物种相关的结构，因此仍受到限制。另一个限制因素是许多丝状真菌的低转化效率。这些问题限制了大范围的基因功能的研究。虽然许多基因的基因组信息已经被发布，但大规模的功能基因组研究由于缺乏高通量的方法而仍然受到限制。 为了开发新的研究丝状真菌功能基因组的工具，我们利用Invitrogen’s Gateway 技术。Gateway克隆系统开发了物种，它是利用λ-噬菌体可以在质粒之间来回穿梭并在复合位点相容的特点来构建的。这个系统是非常有用的，特别适合高通量实验。这种方法能在拟南芥，秀丽线虫，人类和其它生物体找到，没有物种的特殊界限。 在这篇文章中描述了两种新的高通量功能基因组 工具来研究丝状真菌，此工具是建立在Gateway技术的基础上。 一个系统是Gateway RNAi载体，它在高通量方法中允许真菌的基因沉默。 另一个系统是高通量敲除结构系统(以Gene-blast为基础)。 第一个系统是以RNAi技术为基础的丝状真菌体内高通量沉默系统。 原理：RNAi是探索高等生物基因结构的一种简单，快速，精确的方法。它能在植物，动物，昆虫和其它许多高等生物中关闭基因表达，进而研究基因组的功能。 方法 RNA干扰的基础结构是Silent1 RNAi质粒。pSilent1 质粒从真菌基因组储备中心获得。 第一步，a Gateway conversion A cassette 包含Gateway系统的再结合位点，氯霉素抗性基因，ccdB基因，pSilent1的Xhol位点。 第二步，另一个Gateway A cassette在反方向插入StuI位点。两个连接步骤产生了质粒pTroya。结构通过限制性图谱和克隆位点附近的序列所证实。 第三步，应用BP重组反应，将基因PCR 扩增后纯化的片段导入到pENT221载体，形成Gene X RNAi入门载体。 第四步，LR 重组反应：利用Invitrogen 公司的LR 重组试剂盒， 将克隆至 pENT221上的PCR片段与目标载体pTroya 按照LR 重组试剂盒说明书进行重组反应，形成质粒pTroya-geneX。 第二个系统是丝状真菌的高通量基因敲除系统。 原理：利用同源重组作为研究结构工具用高通量方式敲除片段，以Gateway三部分复合系统为基础的新基因敲除系统。 方法： 在ORF中酶切三个携带有attB 位点的目的片段（5’selection marker-HygR, 3’)执行三种不同的PCR方法，建立一个PAC1的Gene-blast。 炭疽病菌基因组DNA5’端应用寡聚序列引物1和2进行PAC1的第一个PCR。 质粒pGEM中以潮霉素为选择标记基因使用寡聚序列引物3和4进行第二个PCR。 炭疽病菌基因组DNA3’端应用寡聚序列引物5和6进行PAC1的第三个PCR。 这三个PCR的产物使用Qiaquick Kit 进行凝胶纯化，使用标准BP重组反应在质粒中进行亚克隆。将三个PCR片段导入pDONRP4-P1R, pDONR221, pDONR P2R-P3形成三个入门载体GeneX5’, HYG，GeneX3’，插入的潮霉素基因开始克隆并通过测序来证实。三种不同的质粒与pDESTR4-R3混合，通过LR重组反应建立Gene-blast pac1。建立的结构被设计去敲除PAC1中从ATG到终止密码的序列。 为了证实Gene-blast系统的有用性，我们已经在2个炭疽病菌基因GDH2和GS1中建立了缺失片段结构。这种片段被转入到炭疽病菌中，通过PCR来检测转化子的正确组合。 我们使用具有广泛寄主的植物病原真菌炭疽病菌来测试我们新的平台。为了测试新的分子工具，这些结构系统通过用炭疽病菌的PAC1基因来检测。它是炭疽病菌的一个PacC同原体 。PAC1基因在特定的PH状况有不同的表达，并通过病原菌被诱导。 新的质粒pTroya-pac1被用来去沉默内生的PAC1。挑出16个单孢子菌落，其中8个菌落在PAC1的表达