杆状病毒表达系统(昆虫细胞的培养及杆状病毒滴度测定)PPT.ppt

* 杆状病毒表达系统 疫苗实验体液免疫与细胞免疫的检测 杆状病毒表达系统 昆虫细胞的培养 重组pFastBac质粒的构建 重组Bacmid的产生与鉴定 获得重组杆状病毒 蛋白表达病毒扩大 Overview Bac-to-Bac Baculovirus Expression System能快速并有效的获得重组杆状病毒，其重组是基于供体质粒表达盒与杆状病毒穿梭载体Bacmid间发生位点特异性转座。 供体质粒pFastBac：靶基因位于杆状病毒特异启动子下游 DH10Bac：杆状病毒穿梭载体Bacmid + 辅助质粒 Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理 Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理 Insect Cell Lines： Sf9 or Sf21 cells ——主要用于转染，空斑实验和滴度测定 High Five? cells or Mimic? Sf9 cells ——转染效率低，主要用于蛋白表达 Graces Insect Medium with L-glutamine and supplemented with（pH 6.5）： 3330 mg/L lactalbumin hydrolysate3330 mg/L yeastolate 350 mg/L NaHCO310% heat-inactivated fetal bovine serum 昆虫细胞的培养 Atmosphere：air, 100% pipetting across the monolayer scraping cell scrapers hitting the flask against the palm of your hand Temperature：27.0—28.0 ℃ Subculturing： Preservation： 90% serum, 10% DMSO 严格程序降温，-80 ℃过夜后转移液氮保存。 昆虫细胞的培养 重组pFastBac质粒的构建 选择合适的载体 重组Bacmid的产生 重组Bacmid的鉴定 PCR法: pUC/M13 Forward and Reverse primer 或者pUC/M13 Forward or Reverse primer and a primer that hybridizes within your insert Bacmid DNA ≥135kb 获得重组杆状病毒——转染Sf9 cells 1. 小提好的Bacmid DNA，置4 ℃不超过1周 2. 转染试剂：Cellfectin? ⅡReagent 3. 转染后细胞的形态变化 细胞变大 增殖明显变慢或不增殖 裂解 脱落 融合(VSV/G) 或 4. 收毒，短期内4 ℃避光保存，长期保存分装后置-80 ℃ 病毒扩增蛋白表达 扩增病毒：接毒量为 0.05—0.1 MOI 一般情况下，P1代毒滴度大概为1×106 — 1×107 PFU/ml， P2 代毒滴度1×107—1×108 PFU/ml 比如：P1代毒滴度为5×106 PFU/ml，T75细胞瓶的细胞量 2×107cells，那么 蛋白表达：接毒量为 1—5 MOI 杆状病毒滴度测定 两种病毒滴度测定方法的比较： 空斑实验法测定滴度依赖于病毒在感染细胞中的复制以及感染周边细胞形成局灶型病变；而免疫染色法只需要病毒感染靶细胞并表达病毒所编码的蛋白。因此，免疫染色法（infectious units per ml, or IFU/ml）测定病毒滴度需要的时间比空斑法（PFU/ml）更短。 BacPAK? Rapid Titer Kit 本测定方法，以针对杆状病毒囊膜蛋白gp64的单克隆抗体标记被病毒感染的细胞，然后以HRP-标记的二抗与感染细胞进行染色。通过底物显色，在光学显微镜下计数感染斑点的数量，经过稀释倍数的换算，即可得出病毒的滴度（IFU/ml）。 注意事项： 细胞铺板5 ×106 cells/well，细胞计数要准，台盼蓝染 色，保证细胞活力≥ 95%。 2. 病毒稀释要准，不同浓度之间换枪头，是确保不同稀释 度孔斑点成10倍关系的关键。 3. 整个过程中，轻轻洗板，避免细胞脱落过多。 4. 实验完毕3 h后数斑，效果更佳。 5. 结果判定： 疫苗免疫动物后免疫效力评价 体液免疫检测 ELISA抗体 中和抗体 细胞免疫检测 细胞因子mRNA水平检测—qPCR 细胞因子蛋白质水平检测—ELISA 淋巴增殖实验—MTT法 ELISA抗体 制备良好的抗原包被ELISA板—纯化的蛋白或病毒 3. 设置空白孔（不加血清），统