柯萨奇病毒的RT-PCR实验PPT.ppt

柯萨奇病毒的RT-PCR实验室诊断;属于小ＲＮＡ病毒科肠道病毒属，最易在灵长类动物细胞中生长。 病毒分为Ａ、Ｂ两组。柯萨奇病毒Ａ组有２３个血清型，柯萨奇病毒Ｂ组有６个血清型。;柯萨奇病毒(Coxsackie virus，CV ) 的诊断方法： 病毒分离、动物接种 操作烦琐, 成功率低, 影响诊断的敏感性； ELISA 法 检测患者血清中相应的特异性IgM 、 IgG抗体, 但不能获得有关病毒更多的信息； RT - PCR 法 既可以通过检测病人样本中的病毒RNA 来明确诊断, 也可以通过进一步的测序来分析病毒流行株特定序列, 为基因分型提供依据。;两端为保守的非编码区，中间为编码区。5’端共价结合一小分子蛋白质Vpg（约7kDa），与病毒RNA合成和基因组装配有关；3’端带有polyA尾。编码区编码的病毒结构蛋白VP1～VP4，VP1、VP2和VP3均暴露在病毒衣壳的表面，有中和抗原位点；VP4位于衣壳内部，一旦病毒VP1与受体结合后，VP4即被释出，衣壳松动，病毒基因组脱壳穿入。;逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。 ;RT-PCR实验程序：标本的采集、标本RNA的提取、引物、RT-PCR反应体系、温度循环参数、琼脂糖电泳、凝胶成像、结果判定及序列测定;一步法：反转录PCR在一个管子里完成，得到的全部cDNA产物都一起经PCR扩增，灵敏度更高。 两步法：反转录和PCR分开，灵活而且严谨，但灵敏度不如前者高。 ;RNA操作注意事项;PCR反应系统的组成： ⑴耐热DNA聚合酶（Taq酶）：这是由耐热水生细菌体内提取的一种DNA聚合酶。 ⑵模板DNA：即待分析的目的DNA，其长度不宜大于10kb。 ⑶两种引物：为了保证DNA聚合酶能够对两条互补链均能进行延伸，需要两种引物，分别位于两条互补模板DNA链的3`-端。 ⑷四种脱氧核糖核苷酸：用作底物的dNTPS。 ⑸缓冲溶液：保证DNA聚合酶催化时所需的适当的溶液pH值; PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。;PCR 注意事项;模 板;引 物;Mg2+ 酶;物理原因;出现片状拖带或涂抹带;如何避免污染;TRIZOL法提取核酸 RT-PCR法检测柯萨奇病毒（两步法） 逆转录（RT） 聚合酶链反应（PCR） PCR产物的检测和鉴定 引物：CVB3的3D基因引物 ;TRIZOL法提取核酸 1）取250ul病毒悬液加到1.5ml离心管中，然后加入750ul TRIZOL溶液，混匀5秒后离心。 2）加入200ul 氯仿溶液，充分混匀5秒钟 3）室温放置10分钟后，10000RPM，室温离心20分钟 4）将上清液转移到一支新的1.5ml离心管中 5）再加入500ul异丙醇溶液，摇匀10秒钟 6）室温静置至少15分钟 7）14000RPM，4℃离心25分钟 8）倒掉上清液，加入950ul冰冷的70%乙醇 9）14000RPM，4℃离心20分钟 10）用吸尖小心吸出上清液倒掉 11）室温干燥后加入15ul dH2O，-70℃保存; 逆转录（RT） 配液：RNA 3μl（1μg） 随机引物 1μl 加水至10μl 混匀，瞬时离心，70℃ 5min 立即冰水浴，瞬时离心，依次添加下列试剂 M-MLV Buffer 5×