核酸的体外扩增1PPT.ppt

核酸的体外扩增;1953年Ｗatson和Ｃrick提出了DNA双螺旋结构及其半保留复制模型； 1958年Meselson和Stahl用实验证实了DNA半保留复制模型； 70年代以来，人们采用两种思路去尝试建立基因的无性繁殖体系，一是基因克隆技术；另一种思路是体外扩增技术；;1976年，Chien分离出热稳定DNA聚合酶； 1985年，美国Cetus公司人类遗传研究室的年轻科学家Kary.B.Mullis发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR），Saiki等首次应用PCR法成功地扩增了人?－珠蛋白的DNA，并应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。;1986年Erlish分离并纯化了适用于PCR热稳定TaqDNA Polymerase，1988年获得专利。 1988年Saiki开始将耐热性TaqDNA聚合酶应用于PCR，整个反应只加一次酶即可，扩增特异性和效率都明显改善，使操作大为简化； 1989年被誉为“分子年”,列PCR为十余项发明之首，PCR爆炸年； 1993年，Mullis荣获诺贝尔化学奖。;聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR);PCR的基本原理;PCR全过程每一步的转换是通过温度的改变来控制的。需要重复进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高温变性、低温退火、中温延伸３个步骤构成PCR反应的一个循环，此循环的反复进行，就可使目的DNA得以迅速扩增。 PCR反应体系：耐热的Taq DNA聚合酶、化学合成的寡聚核苷酸引物(primer)、4种dNTP、以及合适的缓冲液体系。;DNA模板变性（DENATURE）：模板双链DNA?单链DNA，94℃ 退火(ANNEALING)： 引物＋单链DNA?杂交链，引物的Tm值 引物的延伸（ELONGATION）：温度至70 ℃左右， Taq DNA聚合酶以４种dNTP为原料，以目的DNA为模板，催化以引物３’末端为起点的5’→3’DNA链延伸反应，形成新生DNA链。 新合成的引物延伸链经过变性后又可作为下一轮循环反应的模板PCR，就是如此反复循环，使目的DNA得到高效快速扩增。;理论扩增率：2n指数递增（n为循环次数），扩增25～30个循环，目标DNA可增加109倍。 实际扩增率：（１＋Ｘ）n，X为PCR的实际扩增率，平均约为75%.由于引物和底物的消耗，Taq酶活力的下降等因素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式变为线性形式，所以实际上进行30个循环后，扩增倍数一般可达106～107。以上“变性、退火、延伸 ”三部曲为PCR一轮循环。;二、PCR引物设计;引物设计的基本要求;引物自身不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。引物的连续互补序列，一般不超过3bp。 两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3’端的互补重叠。 引物与非特异扩增区的序列的同源性不超过70％，引物3’末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。;引物3’端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3’端最佳碱基选择是G和C，形成的碱基配对比较稳定。 引物与模板结合时，引物的5’端最多可以游离十几个碱基而不影响PCR反应的进行。 引物的5’端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列包括起始密码子、终止密码子等。;模板的制备;PCR基本反应;以mRNA为模板的反应：逆转录-PCR (reverse transcription-PCR，RT-PCR) 25/50ul 以mRNA为模板 其中含有：RNasin(RNA酶抑制剂)、缓冲液(Tris-HCl和KCl)、4种dNTP、MgCl2、DTT、牛血清白蛋白、RNA模板、引物、逆转录酶。 逆转录反应在42℃进行，随后将反应混合物加热至95℃ 5分钟，灭活逆转录酶。按DNA为模板的PCR反应步骤，进行扩增反应。;PCR产物的积累规律 初期，目的DNA片段的增加呈指数扩增，随着目的DNA扩增产物的逐渐积累，酶的催化反应趋于饱和，DNA扩增产物的增加减慢，进入“平台期”。 平台期出现的迟早取决于样品模板的拷贝数、PCR的扩增效率、DNA酶种类和活性，以及非特异性产物的竞争等因素。;PCR反应的自动化 聚合酶(Klenow；T4 DNA 聚合酶)耐热性差，需要重新加人聚合酶，手工操作 常用的PCR扩增仪有：①机械手型。②变温金属板作恒温装置，通过半导体加热和冷却金属块来完成温度的变化。③空气加热／光加热循环装置。;PCR反应条件的控制;镁离子浓度 一般用量1.5-2.0 mmol/L，Taq DNA聚合酶活性需要Mg 2