植物的原生质体培养PPT.ppt

植物的原生质体培养;主要内容;原生质体(protoplast)： 指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露球形细胞。;细 胞;微 丝;原生质体用途;原生质体培养的意义; 二、 原生质体的制备 不同的植物细胞，由于细胞壁的组成、结构和性质有所不同，原生质体的制备方法也不一样。 1、用于分离原生质体的材料准备：选取生长旺盛的细胞，幼嫩的组织。 ?无菌试管苗叶片 ?上胚轴和子叶 ?培养细胞（愈伤组织）;2、原生质体的分离 1）、机械法：利刃机械切割 2）、酶解法：果胶酶和纤维素酶处理;1）机械法;? 优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。 ? 缺点： 1) 手工操作难度大，原生质体得率低，费时费力，难以大量制备。 2）能够用此法产生原生质体的植物种类受到限制。;2）酶解法;?酶解制备原生质体过程;1）材料预处理 (暗处理，预培养和低温处理) 在酶处理前，常把供体组织置于合适浓度的稳压液中，使细胞预质壁分离约一小时后再用酶液处理。 原因：预质壁分离可使胞壁内表层充分暴露，增加胞壁降解酶与胞壁的接触面而提高胞壁降解速度；降低原生质体内电解质渗漏，防止在分离期间外来酶被吸入细胞内，降低原生质体对酶液中可能存在的有害影响的敏感，提高原生质体的稳定性和存活率。;A、酶溶剂及其渗透压 ?酶的种类 ?酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制、PH値。 ?渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。 B、酶解时间：酶浓度及温度。;酶的种类和浓度;酶液渗透压; 其它;3）原生质体分离过程：一步法（以烟草叶片为例）;图示原生质体分离过程（以叶片为例）; 以愈伤组织为材料分离原生质体。;3、原生质体的收集和纯化：; 1）离心沉淀法 筛网过滤（400目）除去未消化的细胞、细胞团和碎片后在适当试剂（甘露醇）内低速离心。 优缺点： ? 比较简单 ? 但不易除尽一些完整的细胞，或引起原生质的破碎;2）飘浮法 据原生质体比重小能在一定渗透压的溶液（如25%的蔗糖）中漂浮得到收集。 优缺点： 可以得到较为纯净、完整的原???质体。 但完好的原生质体数量较少。 3）沉淀法和飘浮法结合 先沉淀后漂浮，重复操作，纯化后可用于培养或细胞融合。;4）接口法（界面法）;以柑桔为例;原生质体分离纯化流程图; ?目的：检验获得的原生质体是否真正的原生质体 ?鉴定方法(针对有无细胞壁)：;5、原生质体活力检测;6、影响原生质体活力的因素 ? 分离材料的生理状态； ? 酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压； ? 分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间； ? 环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响。;二、原生质体的培养;（二）原生质体培养方法;;（三）影响原生质体培养的主要因素;三、原生质体的发育和植株再生;一般包括如下几个步骤： 1）细胞壁再生： 体积膨大，叶绿体重新排列，新的细胞壁开始合成，细胞由球形变成椭圆形。;2）分裂： 一般在培养2-3天后细胞质增加，细胞器增殖，DNA、蛋白质等合成增加，细胞分裂，形成小的细胞团，发育成愈伤组织或胚状体。 3）植株再生 ;第一次分裂;第三次分裂;;愈伤组织;愈伤组织;植物原生质体培养的应用;四、原生质体研究的趋势 ? 1、低密度和单个原生质体培养； ? 2、单倍配子体如花粉原生质体培养； ? 3、计算机控制系统、流式细胞光度计等技术的应用。;;;;