段旭昌免疫磁珠分离技术(IMB)及在食品生产中的应用PPT.ppt

免疫磁珠分离装置 免疫磁珠分离装置由超强磁铁分离器和分离柱组成。磁铁和分离柱的型号多样，配合0.5ml、1.5ml微量离心管，15ml及50ml离心管或试管，和96孔或384孔培养板中样品的分离 ，以满足不同试验要求。 十一 免疫磁珠分离技术的应用 分离抗原抗体 分离蛋白和多肽 分离多糖物质 分离DNA和RNA 分离细胞和病毒 靶向释药系统的载运 食品有害微生物分析与检测 磁珠法分离抗体、抗原、蛋白、多肽、多糖、DNA、RNA操作过程示意图 μMACS Vitalvirus Hiv分离试剂盒分离标记造血细胞表面的Hiv-1病毒CD44H异型细胞 免疫磁珠标记细胞示意图 免疫磁珠分离细胞及病毒示意图 十二 免疫磁珠在食品安全检测中的应用 免疫磁珠对病毒细胞具有特异选择性，因此能用于食品有害微生物的检测。 免疫磁珠技术与常规检验方法相比具有检测迅速、有选择性分离目的微生物，有效减少背景干扰，提高了精准性。同时还能捕获受损伤靶细菌。目前，免疫磁珠技术已广泛用于食品样品中致病微生物的检测。 大肠杆菌O157的检测 传统分离E.coli O157∶H7所采用的直接分离法存在着鉴别力差、抑制杂菌能力弱、耗时长、工作量大等缺点。 采用免疫磁珠技术，能够快速地从各种食品样品中分离富集E.coli O157∶H7，满足流行病学的研究要求和提高控制力度。 现在这种免疫磁珠的方法已经被英国公共健康服务实验室认定为标准的分离方法，我国也已将免疫磁珠法对大肠杆菌O157的检测纳入国家标准（GB/T 4789.36-2008）和出入境检验检疫行业标准(SN/T 1059.5-2006)。已有市售的专用免疫磁珠销售。 检样 25g(mL)+225mL改良EC肉汤（mEC+n），均质225mL 免疫磁珠捕获 涂布CT-SMAC平板和改良CHROMagar O157弧菌显色琼脂平板 挑取可疑菌落5个~10个，氧化酶阴性，革兰氏阴性杆菌接种TSI MUG-LST 阳性 GB/T 4789.36-2008 免疫磁珠捕获法检测O157∶H7程序 阴性 血清学试验 非O157细菌 生化试验 报告 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 36± 1oC 18h~24h 36± 1oC 36± 1oC 18h~24h 18h~24h 1增菌???? 2免疫磁珠捕获与分离 1.将Eppendorff管按样品和质控菌株进行编号，每个样品使用1支Eppendorff管，然后插人到磁板架上。在漩涡混合器上轻轻振荡E. coli O157免疫磁珠溶液后，用开盖器打开每支Eppendo - rff管的盖子，每管加人20 μL E. coli 0157免疫磁珠悬液。 2.取mEC+n肉汤增菌培养物1 mL，加人到Eppendorff管中，盖上盖子，然后轻微振荡10 s。每个样品更换1支加样吸头，质控菌株必须与样品分开进行，避免交叉污染。 具体操作 3.结合: 在18℃~30℃环境中，将上述Eppendorff管连同磁板架放在Dynal MXl样品混合器上转动或用手轻微转10 min，使E. coli O157与免疫磁珠充分接触。 4.捕获:将磁板插人到磁板架中浓缩磁珠。在3 min内不断地倾斜磁板架，确保悬液中与盖子上的免疫磁珠全部被收集起来，此时，在Eppendorff管壁中间明显可见圆形或椭圆形棕色聚集物。 5.吸取上清液:取1支无菌加长吸管，从免疫磁珠聚集物对侧深人液面，轻轻吸走上清液。当吸到液面通过免疫磁珠聚集物时，应放慢速度，以确保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液内含有磁珠，则应将其放回到Eppendorff管中，并重复4步骤。每个样品换用1支无菌加长吸管。 6.洗涤:洗涤免疫磁珠混合物，重复上述步骤 4~ 6 和4 ~ 5 。 7.免疫磁珠悬浮:将免疫磁珠重新悬浮在100 μL PBS-Tween 20洗液中。 8.涂布平板:用漩涡混合器将免疫磁珠混匀，用加样器各取50 μL免疫磁珠悬液分别转移至CT-SMAC平板和改良CHROMagar O157弧菌显色琼脂平板一侧，再用无菌涂布棒将免疫磁珠涂布平板的一半，用接种环划线接种平板的另一半。待琼脂表面水分完全吸收后，翻转平板，于36℃士1 0℃培养18 ---24 h 。 菌落识别 在CT-SMAC平板上，典型菌落为不发酵山梨醇的圆形、光滑、较小的无色菌落，中心呈现较暗的灰褐色;发酵山梨醇的菌落为红色;在改CHROMaga