沉淀反应2PPT.ppt

（二）散射比浊法类型 终点散射比浊法 速率散射比浊法 1.终点散射比浊法 抗原、抗体相遇后免疫沉淀反应立即开始，但反应达到平衡通常需10～30min。免疫浊度测定应在复合物聚合产生絮状沉淀之前进行，否则光散射值降低，影响测定结果。因此，终点散射比浊通常是在免疫反应进行到一定时间时测量其浊度，故亦可称为定时散射比浊 （1）技术要点 终点散射比浊法需减去本底值 因抗原抗体反应的初期极不稳定，在极短时间内反应介质中散射信号变动大，以此时获取的峰值计算出的结果会产生一定的误差。 检测分两个时间进行：在抗原抗体预反应时段，加入少量样本与抗体反应，几秒钟后测定第一次散射光信号值（本底值）；然后加入全量待检样本，2min后第二次测定散射光信号值，以第二次信号值减去第一次信号值，从而获得待测抗原与抗体反应后形成的复合物颗粒产生的信号峰值，经处理后转换为待测抗原浓度 （2）方法评价 可用自动化仪器测定 反应时间较长 检测灵敏度在微克（μ g/l）水平 灵敏度高于透射比浊法 2.速率散射比浊法 速率散射比浊法是一种先进的动力学测定法，1977年由Sternberg首先用于免疫学测定。 所谓速率是指单位时间内抗原与抗体反应的速度。 抗原与抗体结合形成免疫复合物的速度，在每个单位时间内是不相同的，在抗体过量的情况下，随着抗原量的增加，反应速度越来越快，免疫复合物的总量也迅速增加，出现峰值所需时间逐渐缩短。 即是说，抗原抗体浓度越接近等价带，反应速率越快，峰值越高，而且达到峰值的时间越短。抗体定量时，峰值与抗原量呈正相关。 通常在25s时出现一个反应最快的速率峰。 time 散 射 光 强 度 到达峰值时间 抗原抗体反应的速率变化 峰值 速率散射比浊法是测定单位时间内免疫复合物形成的最快时间段（并非测定免疫复合物的最大量及最稳定期）的散射光信号值。此时因抗体量大于抗原量，形成的免疫复合物是小分子不溶性颗粒，产生的散射信号最强，形成的速率散射信号值最大。 （1）技术要点 适当稀释待测标本和抗原对照品 仪器定标 按仪器操作规程分别放入抗体及待测样本，测定 （2）方法评价 快速（30~60s完成检测） 特异、灵敏（ng/l）、精密度高、节省试剂、检测范围宽 高度灵敏、快速的自动化免疫比浊测定法 三、速率抑制免疫比浊法 一种竞争性结合或竞争性抑制试验，主要用于测定半抗原和药物等小分子物质。 试剂中的特异性抗体是由半抗原与载体蛋白偶联后，免疫动物制备而成。 试验时先将一定量的已知半抗原-载体（大分子）与限量的特异性抗体发生反应，生成的免疫复合物可形成一定的速率散射峰值。 当反应系统内加入待检标本时，其中所含的半抗原（小分子）与抗体竞争结合，使大分子的半抗原-载体-抗体复合物的形成受到抑制，速率散射峰值降低，其降低程度与标本中的待测半抗原（或药物）成正比，根据标准曲线可计算出标本中待测物质的含量。 四、免疫胶乳浊度测定法 在上述比浊法中，少量的小的抗原抗体复合物极难形成浊度，除非放置较长时间；如形成较大的复合物，则抗原和抗体用量也较大，显然不符合微量化的要求，于是发展了免疫胶乳浊度测定。 又称为粒子强化免疫浊度测定法，是一种带载体的免疫比浊法，可以提高免疫浊度测定的灵敏度，满足试剂微量化的要求。 （一）原理 将抗体吸附在大小适中、均匀一致的胶乳颗粒上，当遇到相应的抗原时，则使乳胶颗粒发生凝集。单个胶乳颗粒在入射光波长之内不阻碍光线透过，两个或两个以上胶乳颗粒凝聚时，则使透过光减少，这种减少的程度与胶乳凝集的程度呈正比，当然也与待测抗原量呈正比。 （二）关键点 选择适用的胶乳，颗粒大小（直径）要稍小于波长，目前多用200nm的胶乳颗粒，入射光波长为340nm。 胶乳和抗体的结合最好采用吸附法，因化学交联法易使抗体失活。 （三）方法评价 灵敏度高于普通比浊法，可达ng/l或pg/l水平 操作简便，易自动化 五、免疫浊度分析的影响因素 抗体试剂的质量 抗原抗体反应的比例 抗原抗体反应的条件 增浊剂的作用 标本 （一）抗体试剂的质量 1．抗体的质量：免疫比浊测定法要求抗体的特异性强，效价高，亲和力强。 2．抗体的类型 ：根据抗血清来源的动物种类不同，抗体可分为R型（rabbit type）和H型（horse type）。 R型抗体是用于免疫比浊测定的较为理想的试剂。 抗体可按等价带范围大小分为两种类型，即R型抗体和H型抗体。R型抗体以家兔免疫血清为代表，具有较宽的抗原抗体合适比例范围，只在抗原过量时，才易出现可溶性免疫复合物，大多数动物的免疫血清均属此型。 H型抗体以马免疫血清为代表，其抗原与抗体的合适比例范围较窄，抗原或抗体过量，均可形成可溶性免疫复合物，人和许多大动物的抗血清皆属H型。 （二）抗原抗体反应的比例 浊度法中的免疫反应