生化课件07PPT.ppt

3. 缓冲液性质 酶活性下仅受缓冲液pH影响，也受缓冲液性质的影响，选择缓冲液应考虑的因素。 （1）缓冲液中弱酸的解离数pka必须接近酶测定时的Ph。如ALT测定pH7.4（磷酸pka6.7）LDH测定pH8.8，（二乙醇胺pka8.8）ALP测定pH10（碳酸pka10.32）。 （2）缓冲液对酶活性无抑制作用，如甘氨酸对LDH、ALP有抑制作用。 （3）缓冲液在酶反应体系中不会发生降解或破坏。 （4）缓冲液在可见光区或紫外区没有成仅有极低光吸收现象。 一、同工酶的概念 1971年国际生化学会（IUB）提出同工酶是指同一种属中由不同基因位点或等位基因编码的多肽链单体，纯聚体或杂交体，其生物性质不同但能催化相同反应的酶。 同工酶的分布除了具备组织器管特异性外，在同一细胞的不同细胞器中也有不同的分布，这对于提高疾病的诊断有重要意义。 第三节 同工酶测定 （一）电泳法： 常用的电泳材料有醋酸纤维薄膜、琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等。 （二）层析法 主要有两种 1. 离子交换层析 利用同工酶表面电荷的不同，与离子交换树脂结合，常用的离子交换剂有二乙氨基乙基纤维素（DEAE-C）、二乙氨基乙基葡聚糖A-50（DEAE-SephadexA-50）等。 分离方法 2. 亲和层析法 利用多基因位点的同工酶具有不同免疫学特性和不同底物专一性，将特异性配体（如抗体）用固相化技术结合在葡聚糖或琼脂糖凝胶上，样品通过层析柱时，凝胶就能选择性结合某一同工酶，而让其他同工酶通过，然后用洗脱剂洗脱。 评价 可用于同工酶的提纯制备，但费时。 （三）免疫化学法 利用同工酶的抗原性不同进行分离，主要适用于基因位点的同工酶。 1. 免疫抑制法 利用同工酶的某一亚基与相应抗体结合后，酶活性受抑制，而不含这种亚基的同工酶不受影响。故测定加与不加抗体样品中酶活性的差别，可推并且该型同工酶的活性，如在CK同工酶中加入足备的CK-MM抗体，则： CK-MM活性全部被抑制 CK-MB活性抑制50％ CK-BB活性不受影响 2. 免疫沉淀法 在含有A、B两型同工酶的混合样品中，加入A（或B）的抗体，使A（或B ）沉淀，离心后测定上清液中酶活性，可代表B（或A）的酶活性，用加入抗体前测得的总活性减去上清液酶活性，即得出被沉淀酶活性。 3. 免疫测定酶蛋白法 酶是蛋白类抗原，可用各种免疫定量法来测定，火箭电泳法、放射免疫法（RIA）、酶免疫法（EIA），其中后两者灵敏度可达10－9～10－12g水平。 评价 RIA是目前测定同工酶最可靠、灵敏和特异的方法，但方法较复杂，有放射性污染。 （四）动力学法 1. 利用同工酶对底物专一性不同进行分离 如A型醛缩酶（ALD-A）对FDP和F-1-P的活性比值为50，而B型醛缩酶（ALD-B）对FDP和F-1-P的活性比值为1。根据此样品对FDP和F-1-P的活性比值，可大致反映其ALD-A和ALD-B的比例。 2. 利用同工酶有不同的最适pH和不同底物的Km进行鉴定 如AST的最适pH为7.4，当pH为6.5时，血浆AST（s-AST）活性明显下降，而线粒体AST（m-AST）仍可保持。另一方面，m-AST对L-ASP的Km为0.7mmol/L，远小于s-AST的Km 5.07mmol/L，因此在pH6.5，L-ASP浓度为5mmol/L，测定的是m-AST活性，而在pH7.4，L-ASP浓度为200mmol/L，测定的是AST活性。 评价 简单快速，不需特殊设备，也不需分离同工酶就可测定，但准确性较差。 （五）热失活法 利用各型同工酶对热稳定性不同而设计的方法。如ALP同工酶的热稳定性依次为：ALP4ALP2ALP5ALP3 当血清在60℃加的热30mim，其它同工酶都以失活，而ALP4仅失活5％。 评价 最简单易行，不需任何外加试剂特殊仪器，但准确性差，不能准确定量，只能大致估计。 第一节 酶活性测定的基本知识 酶是一种生物催化剂，其化学本质是蛋白质。它在体内含量极微，每ml仅为pg水平，要直接测定其绝对量是十分困难的，目前是根据其催化反应速度来定量，称为相对定量