生物化学实验课.PPTPPT.ppt

生物化学实验 用离心、电泳、层析、分光光度等技术对生物分子尤其是生物大分子进行分离、提取、纯化和鉴定。 考核办法： 平时考查：20% 实验报告：20% 笔试成绩：60% 实验内容： 实验37 醋酸纤维薄膜电泳分离蛋白质 实验3 唾液淀粉酶活性观 实验20 血浆IgG的分离制备 实验32 IgG的凝胶层析脱盐 实验38 聚丙烯酰胺电泳分离蛋白质 实验43 乳酸脱氢酶同工酶的电泳分离 实验50 质粒DNA提取与鉴定 实验48 酶联免疫吸附测定 实验一 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质 教学目的： 了解电泳的一般原理、掌握醋酸纤维薄膜电泳操作技术 实验原理、点样、电泳槽组装、 结果观察、透明各环节的把握 重点难点： 一、原理: 以醋酸纤维薄膜为电泳支持物，分离各种血清蛋白。 血清中的各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、等电点、分子量及形状不同，在电场中迁移速度不同。 我国正常人血清蛋白质组成 + _ pH8.6 原理 三、操作 1. 确定膜的非光泽面后，提前30 min润湿薄膜。 2. 制作电桥。（2层滤纸或4层纱布） 操作 3. 点样： 薄膜非光泽面朝上平放在滤纸条上 用玻片取样垂直的印在薄膜边缘1.5cm处形成一 定宽度、粗细均匀的直线 操作 样 品 带 窄 而 均 匀 4. 电泳： 薄膜点样面朝下，样品端朝负极平贴在电泳槽支架上，盖盖使膜平衡10 min。 操作 4. 电泳： 起始电流0.6mA/片，电泳10—15min后调至1mA/片，电泳50 min。电流回0，关机。 5. 染色2 min，漂洗液脱去背景颜色。 染色液重复使用 操作 置甲液2min，乙液1min， 贴于载玻片上，2min膜完全透明。 6. 透明： 7. 观察分析结果 电泳图谱显示的内容： 正负极 条带数目 条带宽窄 条带颜色深浅 条带形状 条带间距 操作 四、实验报告的格式及要求： 原理、操作（简明）。 铅笔绘电泳结果图谱，图谱要求显示以下内容： 正负极、条带数、条带间距、带型和各蛋白 质条带的名称。 3. 要求字迹整洁。 五、思考题 电泳的一般原理； 醋酸纤维薄膜电泳的特点； 根据人血清中血清蛋白各组分等电点，如何估计 它们在pH8.0的巴比妥-巴比妥钠电极缓冲液中 移动的相对位置。 实验二 唾液淀粉酶活性的观察 教学目的 掌握酶的化学本质； 酶催化作用的特点； 了解酶活性观察实验的设计特点。 实验原理； 实验现象的观察； 实验条件的把握。 重点难点 一、原理 酶活力 —— 酶催化化学反应的能力 加碘液跟踪水解过程： 淀粉 淀粉酶 淀粉酶 糊精 麦芽糖 + 葡萄糖（少量） 蓝色 紫色 红色 黄色或无色 蓝色 无色 时间短，酶活性高即酶的最适条件 酶活力受环境因素的影响。本实验通过观察温度、pH、激活剂、抑制剂等对酶活性的影响，掌握酶作为 生物催化剂的作用特点。 二、操作 （表3-1不做） 小组1位同学先用蒸馏水漱口三次，然后口含20ml蒸馏水2min，吐入塑料水杯，即得酶液。 1、唾液淀粉酶的制备 2、温度对酶活性的影响 操作 淀粉 + pH6.8缓冲液 + 酶液 冰浴 沸水浴 37℃