第五章 细胞衰老与凋亡PPT.ppt

流式细胞术分析 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。 磷脂酰丝氨酸外翻分析 Annexin-V是一种分子量为35-36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。 DNA损坏后的p53的活化是通过pk激酶的级联反应来调节的。 ATM 激酶 (mutated in the familial cancer syndrome ataxia telangiectasia) 被DNA的损坏所激活，并磷酸化Chk-2激酶。 Chk-2激酶在丝氨酸15和20位点磷酸化p53，破坏Mdm2-p53相互作用。 P53的一个目的基因是CKI p21CIP1，此基因抑制 cyclin E 和cyclin A/CDK 复合体，引起G1期的停滞。 Bax基因也可被p53活化。 细胞凋亡的蛋白质调控因子 肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）能够诱导细胞凋亡。 TNF是一类主要由激活的巨噬细胞产生的细胞因子，能够通过激活Caspase蛋白酶、转录因子NF-κB、有丝分裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）等途径，实现其细胞毒性、抗病毒、免疫调节及转录调节等多种生物学活性。 着重介绍TNF诱导细胞凋亡的信号转导途径. （1）TNF配体家族 TNF家族成员有：TNF-α、LT-α、LT-β、FasL、CD40L、CD30L、CD27L、4-1BBL、OX40L、TRAIL、TRANCE等。 TRAIL又称Apo-2L，与Fas/Apo1很相似，C端也可以形成三聚体。TRAIL的胞外区能够介导淋巴细胞和多种肿瘤细胞系凋亡。 TRANCE（TNF-related activation-induced cytokine）细胞外区和TRAIL、FasL及TNF相似。TRANCE受T细胞及Ca2+调节的转录因子的调控，在淋巴器官的T细胞中表达水平最高。 （2）TNF受体超家族 TNF配体家族的成员是通过与细胞膜上的相应受体结合，激活受体，而启动细胞内诱导细胞凋亡机制的。 TNF受体家族成员：TNFR1、TNFR2、Fas、CD40、NGF-R、CD30、TNF-RP、PV-T2、PV-A53R、4-1BB、OX40、CD27、DR3、CAR1、DR4、DR5、TRID等。 TNFR1、Fas、NGFR、DR3、CAR1、DR4包含有死亡结构域（death domain, DD）。 DR3 ( death receptor 3 )表现出诱导细胞凋亡及激活转录因子NF-κB两种生物学活性。它和TRADD、TRAF2、FADD、RIP和FLICE等都能够结合，并通过它们转导信号。 DR4是TRAIL的受体，不能和TRADD、FADD、RIP相互作用，TRAIL-DR4是通过其他的途径转导凋亡信号的。 DR5也是TRAIL的受体, C端是死亡结构域。DR5和DR4具有很高的同源性。DR5不能和FADD及TRADD相互作用，因此，它也是通过其他的途径传递信号的. TRID(TRAIL receptor without an intracellular domain)，亦称DcR1(decoy receptor 1)，也是TRAIL的受体，它具有保护正常组织免受TRAIL介导的细胞凋亡作用，其显著的结构特点是没有胞内区，所以它和配体结合后，不转导信号。 CAR1是鸟类造血细胞组织增生症病毒（ALV）受体，其胞内区是死亡结构域。该受体激活后能够诱导鸟类细胞凋亡。 小结： 总之, 细胞凋亡是一个非常复杂的过程,它受到许多因素的调控与影响, 这些因素在胞内相互影响共同作用,它们的平衡最终决定了细胞的生长或死亡。 2.3、细胞凋亡的检测方法 形态学技术 琼脂糖电泳技术 DNA片段原位标记法 ELISA Caspase-3活性的检测 磷脂酰丝氨酸外翻分析 2.3.1、形态学技术 光学显微镜和倒置显微镜 （1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚