2014年0九月18日细胞培养平台课.pptVIP

消 化 培 养 法 消化培养法所用的酶有多种，目前应用最广的是胰蛋白酶。它是一种内切酶，可专一水解有精胺酸或赖氨酸的羧基形成的肽键。从而消除妨碍细胞生长的细胞间质，包括基质、纤维等，使细胞分散，易于贴壁并从外界吸收养分和排除代谢物 。 消化法适用于组织量大的原代培养。胰蛋白酶液适用于消化间质少的组织，如羊膜、胚胎、上皮、肝和肾等组织及传代细胞。 悬浮型 见于各种造血系统肿瘤细胞和血液细胞 胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长 容易大量繁殖 六、培养细胞生长的条件 营养 生存环境 温度: 37 ℃ O2 CO2: 5% CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3- pH: 7.0-7.2 渗透压 无污染 无毒 组织培养室的设施及条件 压力蒸汽消毒器：湿热消毒。用途广 电热干燥箱：干热消毒（160℃，2小时）。主要用干玻璃器皿消毒 滤器：过滤除菌。大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌 超净工作台：为细胞操作提供无菌环境 紫外灯 ：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒 七、无 菌 操 作 无菌室的灭菌 定期打扫无菌室 实验前灭菌 实验后灭菌 实验人员的无菌准备 肥皂洗手 穿隔离衣 酒精棉球擦手 无菌操作中常犯的错误 吸管、剪刀等碰到其他器皿 无菌操作中常犯的错误 正确的拿管姿势 错误的拿管姿势 拿吸管时手碰到无菌区 无菌操作中常犯的错误 培养基浸湿吸管底部的棉花 八、细 胞 和 组 织 培 养 将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。 1、组织块培养 直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。 2、细胞培养 一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。 计 数 细 胞 细胞数/ml=计数16格×稀释倍数 ×104 细胞数/ml=计数16格个数/个数×稀释倍数×104 培养细胞的观察 每隔一定时间观察一次 是否生长良好 形态是否正常 有无污染 培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示） 定时检查培养温度和CO2浓度 概 念 原代培养 直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为原代培养，而改称为细胞系。 传代培养 细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。 取 材 理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。 细 胞 培 养 的 准 备 工 作 九、原 代 培 养 组 织 块 法 新鲜取材的组织中 细胞仍具有分裂增殖的能力。将组织切成小块培养在模拟体内的环境中，小块组织的细胞可以游离出来，从培养液中吸取营养，继续分裂生长。 组织块培养法适用范围广，常用于肝脏、皮肤、角膜、骨骼、韧带、血管、神经、心脏等器官和组织的培养。 培 养 要 点 材料新鲜 严格无菌操作 剔除脂肪等附着组织 组织块剪小（直径﹤1mm） 摆放开（间距﹥5mm） 常 犯 的 错 误 操作中不换器械 冲洗次数不够 组织碎片太大 组织块摆放太密 培养液加入太多 细 胞 与 组 织 培 养 技 术 李 呼 伦 哈尔滨医科大学神经生物学教研室 2014.09.18 前 言 组织培养技术的应用 基础研究 工业化生产 绵羊B 乳腺细胞核 易核卵 融合卵 绵羊C子宫 多莉 植入 植入 生产 克隆多莉羊示意图 取出 未受精卵 去核 电激 体外胚胎发育 绵羊A 多莉 克隆猴 Park IH, et al. Cell. 2008 Sep 5;134(5):877-86. 病毒组织培养疫苗生产 基因工程产品 层析 和 超滤 分离、浓缩生物大分子 常用的手段 试管婴儿 静止培养 旋转培养 振荡培养 生物反应器高密度培养 厌氧培养 一、细胞培养方式 二、体 外 培 养 的 分 类 体外培养 in vitro 细胞培养 Cell culture 组织培养 Tissue culture 器官培养 Organ culture 体外培养种类 细胞培养 （ Cell culture ）