实验二植物病害生防菌的纯化与鉴定.ppt

实验二 生防菌的纯化和鉴定 一、实验目的 学习放线菌、 酵母菌的纯化培养、制片与鉴定方法，观察放线菌的细胞形态和菌落特征；认识酵母菌的菌落特征，并观察酵母菌的形态及生殖方式。 二、实验原理 从分离培养好的生防菌培养，挑取单个菌落，转接到新的纯化培养基上，每个单菌落划线接种，共挑取3个菌落。或划线涂于斜面试管中培养保存。 三、实验材料 1. 实验材料：放线菌、酵母菌菌株。 2. 试剂：高氏一号培养基、无菌水、石炭酸复红染液、路哥氏碘液，70% 酒精等。 3. 实验用具与仪器：无菌培养皿、盖玻片、载玻片、接种环、三角玻璃棒，酒精灯、微波炉、显微镜。 四、实验步骤 （一）单菌落、单孢分离方法 1.制作高氏1号平板 2. 制作不同浓度的孢子悬浮液 选出现5-20个菌落的皿挑取单孢菌落，制备孢子悬浮液。 3. 划线接种 挑取单个菌落，转接到新的纯化培养基上，每个单菌落划线接种1个皿，或划线涂接于斜面试管中培养保存。 放线菌按培养特征和形态特征鉴定 培养特征指标： 1孢子丝与孢子(即孢子堆)的颜色， 2气生菌丝(即形成孢子前)的颜色， 3基内菌丝的颜色（正面与背面） ， 4可溶性色素的颜色。 除了观察上述色泽外，还观察菌落的特征，如菌落表面呈现的形状、干燥或湿润、气味，菌落的大小、气生菌丝的形状、有无同心环及菌落生长程度。 形态特征指标： 1孢子丝的形状， 2孢子的形态及排列方式， （二）放线菌形态特征的观察方法（插片法） 1. 培养基的制作：高氏1号。 PDA：马铃薯200g、琼脂10g、葡萄糖20g、水1000ml。 2. 插片制作： a. 试管斜面培养的放线菌中加入少许无菌水，或者用接种环挑取菌体少许放入无菌水中制成孢子悬浮液; b. 用无菌吸管吸取孢子悬浮液1滴，加入高氏1号平板培养基上，用无菌刮铲涂抹均匀。 c. 将灭菌的盖玻片，以45度角插入培养基中。 d. 置于28～30℃下培养4～5d。 3. 制片：用镊子取插片一张，吸水纸擦去生长较差一面的菌丝体，然后用镊子夹住盖玻片，使有菌面朝上，通过灯焰2～3次进行加热固定，冷却。 4. 染色：在盖玻片上滴加1滴石炭酸复红染色1分钟，水洗，干燥。 5. 镜检：取干净载玻片一张，盖片染色面向下放在载玻片上，依次在低倍镜、高倍镜、油镜下观察，辨认放线菌的菌丝体，孢子丝及孢子的形态及排列方式（宜用略暗光线观察）。 石炭酸复红染色液配方： 碱性复红(Basic fuchsin) 0.3g， 95% 酒精 10ml; 石炭酸 (phenolcrgstals C.P) 5g； 蒸溜水 95ml， 将碱性复红溶解在95%酒精中，石炭酸溶于蒸溜水中，两溶液混合即成。 酵母菌形态及特征的观察 1. 制片：取一干净的载玻片，滴加路哥氏碘液1滴，在超净工作台里用接种环取分离的纯种菌少许，加入碘液中混匀，加盖玻片，待用。 2. 镜检：方法同上，观察酵母菌的细胞形态及生殖方式。 3. 菌落观察：仔细观察平板培养基上的孤立菌落，记载所观察酵母菌种类的菌落特征。 注意：1. 加盖玻片时，以一边先接触液体，勿使产生气泡 ； 2. 用完油镜后一定要将镜头上的油擦干净。 五、实验结果的观察记录 1. 放线菌菌落特征： 菌落特征：圆形、较小、干燥、质地致密，表面粉粒状或绒毛状，有呈同心环或辐射状。皿内菌丝与培养基紧密结合，用针难以挑取。菌丝体与孢子常具不同色素，故菌落正面和背面可显示相应颜色。有的种类可散发特殊气味。 形态特征：菌丝体成分枝丝状，发达。孢子有球形、椭圆形、杆状或瓜子型等，常呈串排列或单个存在。 2. 酵母菌菌落特征： 菌落特征一般为圆形，表面光滑，湿润、粘稠，用针易挑取，具油脂光泽，多数种为白色，少数为红色。 形态特征：单细胞，细胞圆形、椭圆形或圆柱形状，较细菌细胞大，具明显的细胞核和肝糖粒、脂肪粒等內含物。 灰霉菌、根霉菌、毛霉菌 青霉菌 二、内容、材料和方法 卵菌纲(Oomycetes)? 霜霉目(Peronosporales) 疫霉属(Phytophthora) 单轴霉属(Plasmopara) 霜霉属(Peronospora) 假霜霉属(Pseudoperonospora) 盘梗霉属(Bremia)