生物化学 第40章 基因工程与蛋白质工程.pptVIP

第40章 基因工程和蛋白质工程 Genetic enaineering Protion engineering 目的基因的获取 1）化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。 2）基因组DNA文库(genomic DNA library) 3）cDNA文库(cDNA library) 4）聚合酶链反应 (polymerase chain reaction，PCR) 二、基因的分离合成和测序 1、基因文库的构建 2、cDNA文库的构建 3、克隆基因的分离与鉴定 4、PCR扩增基因 5、DNA的化学合成 6、基因定位诱变 7、DNA序列的测定 三、克隆基因的表达 基因表达的调控元件 非融合蛋白和融合蛋白的表达 外源基因在真核细胞中的表达 四、蛋白质工程 本部分内容自学 了解DNA克隆的基本原理，了解基因的分离合成和测序、克隆基因的表达 了解蛋白质工程的研究内容及其意义 了解基因工程的应用与展望 2、外源基因与载体的连接 1）粘性末端连接 方式：同一限制酶切位点连接 不同限制酶切位点连接 配伍末端连接 非配伍末端连接 Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 载体自连 目的基因自连 同一限制酶切位点连接 不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接 Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 + EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。 2）平端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 载体自连 目的基因 自连 3）同聚物加尾连接 在末端转移酶（terminal transferase）的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。 5′ 3′ 3′ 5′ 载体DNA 5′ 3′ 3′ 5′ 目的基因 限制酶或机械剪切 限制酶 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ T(T)nT T(T)nT 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ A(A)nA A(A)nA 3′ 5′ λ-核酸外切酶 λ-核酸外切酶 末端转移酶 + dATP 末端转移酶 + dTTP T(T)nT A(A)nA A(A)nA T(T)nT T4 DNA连接酶 15oC 重组体 4）人工接头(linker)连接 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 人工接头及其应用 CCGAATTCG GGCTTAAGC 5′- 3′- Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ 受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) 导入方式 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection) （四）重组DNA导入受体菌 （五）重组体的筛选 1）直接选择法 抗药性标记选择 标志补救(marker rescue) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 2）免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等 (插入失活法) 抗药性标记选择 α互补 α 互补的检测 原位杂交 Southern印迹 鸡的β肌球蛋白的克隆和检出 DNA克隆技术操作过程可形象归纳为 小 结 分 分离目的基因 切 限制酶切目的基因与载体 接 拼接重组体 转 转入受体菌 筛 筛选重组体 * * * 基因重组：DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合。 重组DNA 质粒DNA 基因片段 存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子。 具有自我复制功能。 带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物。 经改造后具有多克隆位点。 举例：pBR322质粒 质粒 重组DNA技术发展史 pSC101 pR6-5 抗四环素 抗卡那霉素 EcoRI 抗卡那霉素基因 DNA连接酶 重组DNA分子 培养平皿 四环素平板 卡那霉素基因 四环素\卡那霉素基因 大肠杆菌 人体生长激素释放激素(SS) 抑制和调节多种激素的作用 从动物脑中提取: 5mg---50万只羊脑 基因工程 9升大肠杆菌