第七章蛋白质的分离纯化与表征.pptVIP

第七章 蛋白质的分离、纯化和表征 第七章 蛋白质的分离、纯化和表征 第七章 蛋白质的分离、纯化和表征 分离蛋白质的目的 许多蛋白质的研究与应用都要获得纯蛋白质。如研究蛋白质的分子结构、组成和某些物理化学性质，需要纯的、均一的甚至是结晶的蛋白质样品。 分离和纯化蛋白质方法的原理 根据蛋白质的之间的各种特性的差异，包括分子的大小和形状、酸碱性质、溶解度、吸附性质和对配体分子的特异生物学亲和力进行分离。 第七章 蛋白质的分离、纯化和表征 蛋白质中的一些氨基酸的侧链有可解离的基团 第七章 蛋白质的分离、纯化和表征 第七章 蛋白质的分离、纯化和表征 (一) 根据化学组成测定最低相对分子质量 如果已知蛋白质分子中含某种微量元素，并已知其含量，则可测定此微量元素的含量，计算出最低相对分子质量。 如肌红蛋白含铁量为0.335% 最低相对分子质量= ×100= ×100=16 700 血红蛋白与肌红蛋白一样，但用其它方法得Mr是68000，所以血红蛋白中含有4个铁。 第七章 蛋白质的分离、纯化和表征 (二) 根据渗透压法测定相对分子质量 当蛋白质分子处于等点时测定的渗透压才不受缓冲 液中无机离子的影响。(范托夫公式) 第七章 蛋白质的分离、纯化和表征 (三) 蛋白质的扩散和扩散系数 平移扩散：由于浓度差引起的溶质分子的净迁移称为平移扩散 扩散系数：当浓度梯度为一个单位时，在一秒钟内通过1cm2面积所扩散的溶质的量。 蛋白质的扩散系数与分子大小和形状及溶剂的粘度有关。 扩散过程受到蛋白质分子与溶剂间的内磨擦阻力所反抗，这种阻力大小不仅取决于蛋白质分子的质量，并且还强力地取决于它的颗粒形状。 菲克扩散定律： 第七章 蛋白质的分离、纯化和表征 (五)凝胶过滤法测定相对分子质量 应用标准蛋白洗脱速度制作标准曲线进行比算。 第七章 蛋白质的分离、纯化和表征 第七章 蛋白质的分离、纯化和表征 (五) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，带有很多负电荷，与蛋白质结合以后，蛋白质分子带有足够的负电荷，远远超过了蛋白质分子原有的电荷，蛋白质分子原有的电荷就变得无足轻重了，所以在电场上移动的速度完全取决于蛋白质分子的大小。SDS可将蛋白质解离成亚基，所以测出的分子量是亚基的分子量 。1.4克SDS/1克蛋白质。不同的蛋白质的SDS复合体具有几乎相同的荷质比。 第七章 蛋白质的分离、纯化和表征 (五) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） 第七章 蛋白质的分离、纯化和表征 (一) 蛋白质的胶体性质 　　稳定胶体具备3个条件： 1.分散相质点大小在1~100nm范围，这在动力学上是稳定的，可不断作布朗运动。 2.分散相质点带有同种电荷，互相排斥，不易聚集形成大颗粒而沉淀。 3.分散相能与溶剂形成溶剂化层，这样质点相互不易靠拢而聚集。 第七章 蛋白质的分离、纯化和表征 (二) 蛋白质的沉淀 蛋白质的稳定性与质点大小、电荷和水化有关。 （1）盐析法：硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等。通常不引起蛋白质变性， 　　　　　　　去盐即可溶解。 (2)有机溶剂沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等。 (3)重金属盐沉淀法：pH＞pI时,蛋白质带负电荷，能与重金属离子作用而变性。 　　　　　　　　　　　　　　如（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+等） (4)生物碱试剂和某些酸类沉淀法：pH＜pI时，蛋白质带正电荷，能与生物碱和酸根负离子作用生成不溶性盐，鞣酸、苦味酸、钨酸、KI；三氯醋酸、磺基水杨酸和硝酸等。　 (5)加热变性沉淀： 第七章 蛋白质的分离、纯化和表征 （1）前处理：细胞破碎，有机械方法如高速组织捣碎器、玻璃匀浆器、在研缽中或球磨机上磨等。还有超声法、反复冻融法、自溶等方法。 (2)粗分离：盐析、等电点沉淀有机溶剂法分离，用PEG浓缩。 (3)细分离：电泳、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、吸附层析等 (4)蛋白质结晶：蛋白质溶液略过饱和。 第七章 蛋白质的分离、纯化和表征 一般是根据蛋白质的分子大小、溶解度、电荷、吸附性质和与配体分子的生物学亲和力等。 (一) 根据分子大小不同的纯化方法 1.透析和超过滤 2.密度梯度(区带)离心 3.凝胶过滤 (1)凝胶过滤的介质 (2)凝胶过滤的原理 第七章 蛋白质的分离、纯化和表征 (一) 根据分子大小不同的纯化方法 1.透析和超过滤 第七章 蛋白质的分离、纯化和表征 (一) 根据分子大小不同的纯化方法 1.透析和超过滤 第七章 蛋白质的分离、纯化和表征 (一) 根据分子大小不同的纯化方法 2.密度梯度离心 常用氯化铯、蔗糖、聚蔗糖（Ficoll）、 (Ficoll)-泛影葡胺(Urografin