22_基因结构和功能分析.ppt

3. 用原位杂交进行RNA区域定位 原位杂交（ISH）是通过设计与目标RNA碱基序列互补的寡核苷酸探针，利用杂交原理在组织原位检测RNA的技术，其可对细胞或组织中原位表达的RNA进行区域定位，同时也可作为定量分析的补充。 （二）用PCR技术检测RNA表达水平 1. 用逆转录PCR进行RNA的半定量分析 逆转录PCR（RT-PCR）一般用于RNA的定性分析；如果设置阳性参照，则可对待测RNA样品进行半定量分析。 2. 用实时定量PCR进行RNA的定量分析 实时定量PCR是定量分析RNA的最通用、最快速、最简便的方法，该方法是对PCR反应进行实时监测，具有很高的灵敏度和特异性。 （三）用基因芯片和高通量测序技术分析RNA表达水平 1. 基因芯片已成为基因表达谱分析的常用方法 基因芯片主要采用cDNA芯片，其便于对不同状态下的基因表达谱进行比较，揭示转录组差异表达的规律，对探索发病机制、评价治疗效果、筛选药物靶标具有重要意义。 2. 用循环芯片测序技术分析基因表达谱 运用循环芯片测序技术，可对基因表达谱进行高通量分析，一次可完成几十万到几百万个DNA分子片段的序列测定，从而快速获得转录组或基因组的全貌。 二、通过检测蛋白质/多肽而在翻译水平分析基因表达 （一）用蛋白质印迹技术检测蛋白质/多肽 （二）用酶联免疫吸附实验分析蛋白质/多肽 酶联免疫吸附实验（ELISA）也是一种建立在抗原-抗体反应基础上的蛋白质/多肽分析方法，其主要用于测定可溶性抗原或抗体， （三）用免疫组化实验原位检测组织/细胞表达的蛋白质/多肽 免疫组化实验包括免疫组织化学和免疫细胞化学实验，二者原理相同，都是用标记的抗体在组织/细胞原位对目标抗原（目标蛋白质/多肽）进行定性、定量、定位检测。 （四）用流式细胞术分析表达特异蛋白质的阳性细胞 流式细胞术（flow cytometry）通常利用荧光标记抗体与抗原的特异性结合，经流式细胞仪分析荧光信号，根据细胞表达特定蛋白质的水平对某种蛋白质阳性细胞做出判断。 （五）用蛋白质芯片和双向电泳高通量分析蛋白质/多肽表达水平 1. 用蛋白质芯片分析蛋白质/多肽的表达谱 根据制作方法和用途不同，可将其分为蛋白质检测和功能芯片两大类。蛋白质检测芯片包括抗体芯片、抗原芯片、配体芯片等，它是将具有高亲和力的特异性探针分子固定在基片上，用以识别生物样品溶液中的目标多肽；蛋白质功能芯片可用来研究蛋白质修饰、蛋白质-蛋白质∕蛋白质-DNA∕蛋白质-RNA，以及蛋白质与脂质、蛋白质与药物、酶与底物、蛋白质-小分子等的相互作用。 蛋白质芯片可用于检测组织∕细胞来源的样品中蛋白质的表达谱；其精确程度、信息范畴取决于芯片上已知多肽的信息多寡。 2. 用双向电泳分析蛋白质/多肽表达谱 双向电泳可同时分离成百上千的蛋白质，对差异表达的蛋白质进行鉴定。 第三节 基因的生物学功能鉴定技术 一、用功能获得策略鉴定基因功能 基因功能获得策略的本质是将目的基因直接导入某一细胞或个体中，使其获得新的或更高水平的表达，通过细胞或个体生物性状的变化来研究基因功能。 方法： 转基因技术 基因敲入技术 （一）用转基因技术获得基因功能 转基因技术（transgenic technology）是指将外源基因导入受精卵或胚胎干细胞（embryonic stem cell），即ES细胞，通过随机重组使外源基因插入细胞染色体DNA，随后将受精卵或ES细胞植入假孕受体动物的子宫，使得外源基因能够随细胞分裂遗传给后代。 转基因动物（transgenic animal）是指应用转基因技术培育出的携带外源基因，并能稳定遗传的动物，其制备步骤主要包括转基因表达载体的构建、外源基因的导入和鉴定、转基因动物的获得和鉴定、转基因动物品系的繁育等。转基因小鼠最为常见。 （二）用基因敲入技术获得基因的功能 基因敲入（gene knock-in）是通过同源重组的方法，用某一基因替换另一基因，或将一个设计好的基因片段插入到基因组的特定位点，使之表达并发挥作用。 通过基因敲入可以研究特定基因在体内的功能；也可以与之前的基因的功能进行比较；或将正常基因引入基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。 基因敲入是基因打靶（gene targeting）技术的一种。基因打靶是一种按预期方式准确改造生物遗传信息的实验手段。除基因敲入外，基因打靶还包括基因敲除、点突变、缺失突变、染色体大片段删除等。 基因打靶与转基因技术均可用于基因功能研究，但二者的最大区别就是基因打靶能去除和/或替换生物体内的固有基因，而转基因技术则未去除或替换固有基因。目前，基因打靶已成为研究基因功能最直接和最有效的方法之一。 二、用功能失活策略鉴定基因功能 基因功能