绵羊TLR4基因的克隆、序列分析和功能验证--杜金苓.ppt

绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证 报告人：杜金苓 导 师：连正兴 单 位：中国农业大学 时 间：2009.10.13 引言 养羊业面临疾病的危险如：布氏杆菌病造成直接经济损失每年达数亿元，间接经济损失每年超过100亿 TLR4: 细胞壁中的LPS、LTA 前炎症因子: IL-6、IL-8、TNF-α等 IFN 实验内容 克隆绵羊TLR4基因 多个克隆测序分析 构建融合蛋白与非融合蛋白表达载体 在细胞水平进行功能验证探讨作用机制 结 果 三种片段长度，比例各不相同 2520bp、2742bp（+222bp）、2353bp(-167bp) pTLR4-IRES-EGFP转染胎儿成纤维细胞 结 论 发现绵羊TLR4基因的三种剪接体 筛选出过表达TLR4基因的成纤维细胞系 初步了解LPS刺激过表达TLR4基因的成纤维细胞后，IL-6、IL-8表达量升高，TNF-α 的表达具有时效关系 ！ * * 布氏杆菌主要侵害生殖系统，引起流产，并可诱发人兽共患，目前已遍布全世界，动物阳性感染率0.36%，人阳性感染率3.28% 革兰氏阴性菌：巴氏杆菌、弯曲菌、布氏杆菌---TLR4基因 (zhengshijun) 引物设计： P2 P3 P1 1.上游引物 2.下游引物： P1`: 5`CGCATCAGGGGATTCTCCTC 3` : (P3)EcoR I 融合蛋白 P3`: 5`TCCCCCGGGGGGTGGAGGTGGTCGCTTCTTGC 3` 非融合蛋白 P3``: 5`TCCCCCGGGTCAGGTGGAGGTGGTCGCTTCTTG 3` Sma I 1.RT-PCR(P1、P1`) 2.菌液 PCR鉴定 I 3.提取阳性菌质粒 1.质粒 PCR (P2: 加入前 51bp) 2.回收纯化 3.连接peasy-blunt-simple载体 4.菌液PCR 5.提取质粒 6.多个克隆测序鉴定 II standard： 2520bp insertion: 2742bp deletion: 2353bp The Journal of Immunology Microbes and Infection 9 (2007) 1359-1367 Ovis TLR4 gene deletion standard insertion exon2 Alternative exon 25+56=83aa 222bp exon1 25+4=29 LPS刺激后， 各种剪接体比例发生变化 寻找开放阅读框构建表达载体 探讨调节机制及功能 outside 1—633 aa TMhelix 634—656 aa inside 657—840 aa SignalP-NN result: Most likely cleavage site between pos. 24and 25: TES-WD Signal peptide: TMHMM: www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ http://www.cbs.dtu.dk/cgi-bin/nph-webface 构建standard TLR4表达载体 酶切鉴定 筛选细胞系 1=pTLR4-IRES-EGFP 2=after digest （7kb 、 900bp ） M=marker pTLR4-EGFP载体：细胞定位 pTLR4-IRES-EGFP载体：功能研究 TNF-α IL-6 IL-8 C TNF-α IL-6 IL-8 T 0.5 0.5 2 2 4 4 8 8 12 12 24 24(h) TNF-α IL-6 IL-8