流感病毒标本采集运输分离检测及注意事项课件.ppt

使用的试剂可靠无误 红细胞悬液浓度是否合适 处理后的血清有无残余非特异性凝集素 选用标准抗血清是否准确 读取HA试验的结果是否正确 4个血凝单位是否准确 红细胞阴性对照 待鉴定病毒确保没有被细菌污染 稀释血清、病毒、红细胞悬液加入量准确 实验方法 优缺点 病毒组织培养（病毒分离） 肯定 至少约5-7天 血清学检测 可靠 耗时 IF 或 EIA 敏感性波动在40-100%，特异性在86-99% RT-PCR方法 敏感特异，检出病毒的最小量为0.01-0.1 TCID 50 荧光定量RT-PCR方法 敏感特异，检出病毒的最小量为0.006-0.02 TCID 50 ，可定量分析 RT-PCR Real-Time PCR NASBA MDD RT-PCR 组成成分 * * 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 * * PCR反应流程图 灵敏度高 皮克(pg=10-12g)量级扩增到微克(ug=10-6g)水平 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 病毒检测的灵敏度可达3个RFU 细菌检测的最小检出率为3个细菌 简便、快速 一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 扩增产物一般用电泳分析 对标本的纯度要求低 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组 织的粗提DNA RNA提取过程中注意事项 RNA分子的纯度 RNA分子的完整性 RNA酶污染问题 外源性Rnase的污染 抑制内源性Rnase的活性 核酸扩增中注意事项 检测试剂的质量 核酸扩增中核酸污染 引物不匹配，造成漏检 灵敏度较RT-PCR高，但是Real-timePCR成本高 谢 谢！ * 国家流感中心 张烨 标本种类 临床标本 鼻拭子、咽拭子、鼻咽吸取物、漱口液等 血清标本 病人的急性期和恢复期血清双份血清 临床样本的选择 采样对象：流感样病例（没有服用过抗病毒药物 ）、人禽流感待查病例 流感样病例:发热（体温≥38℃），伴咳嗽或咽痛之一者，而缺乏其它的实验室确定诊断依据 采集时间：病人发病后的头三天 采样液的要求 采样液应包含有一定量的蛋白质和抗菌素 常用的采样液有：PH 7.4-7.6的Hank’s液，Eagel’s细胞液 采集后应立即放入适当的采样液中低温保存 抗生素名称 终浓度 庆大霉素 0.1mg/ml 抗真菌素 2Ug/ml 采样液的抗生素含量 临床标本的采集法 鼻拭子 咽拭子 鼻咽吸取物 漱口液 若采集的是鼻咽拭子，同一时间采集的标本可放入同一管内 注意：采集禽流感疑似病人标本 最好是下呼吸道吸取物 临床样本收集的注意事项 操作要细心，严防标本间交叉污染，要做好自我保护 采集禽流感疑似病人的标本，最好采集下呼吸道吸取物 采集标本要有一定力度 标本采集后应迅速至于冰上或者4 ℃以下保存，因为流感病毒对热很敏感 标本管标识明确：医院名称，标本号，患者姓名，性别， 采样日期 标本采集后尽量在24小时内送到实验室进行病毒分离。24小时内未能进行病毒分离的标本应放-70 ℃或以下 血清学标本注意事项 血清学最好采集急性期和恢复期的双份血清 采集空腹血 标本必须放在大小适合的带螺旋盖内有橡胶圈的塑料管里，拧紧； 将密闭后的标本放入大小适合的塑料袋内密封；每袋装一份标本； 在采样管上用油性记号笔做好标记用塑料袋密封。同时填写“流感/人禽流感监测病例标本原始登记表”，用另一塑料袋密封； 将装标本的密封袋放入专用运输箱内，放入冰排，然后以柔软物质填充，内衬具吸水和缓冲能力的材料。同一患者2份以上的密封标本，可以放在同一个塑料袋内再次做密封。所有容器必须有生物危险标识。 流感病毒临床标本的运送要求 新鲜的临床采集标本 应在4℃条件下24小时内运送至全国流感监测网络实验室; 未能24小时内送至实验室的，应置-70℃或以下保存 冻存的临床采集标本 应在冻存的条件下，低温送至实验室 含聚丙烯纤维的拭子的采集标本:先将含聚丙烯纤维的拭子在管壁反复挤压后取出 鼻腔或咽部洗液的标本:充分振荡标本管，将粘液打碎。置4℃待其自然沉淀5～