CR类型和应用.ppt

目 录 PCR的反应原理 PCR的类型和应用 PCR示例 7）原位ＰＣＲ 原位聚合酶链式反应（In Still PCR,Is－PCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位和检测病理切片中含量较少的靶序列。 操作步骤 1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入 2. PCR扩增细胞内目的片段 3. 原位杂交检测扩增产物 A.阳性对照 B.阴性对照 C.原位检测mRNA表达 8）ＲＴ－ＰＣＲ 逆转录酶 ＤＮＡ聚合酶 mRNA cDNA 杂化双链 PCR扩增 9) 荧光定量 PCR（real-time PCR) 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标 记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。 内掺式染料 SYBR Green I 序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) 引物特异性探针 Amplifluor (Intergen) 5’ 3’ 5’ 3’ SG SG SG SG SG Excitation Emission SYBR-Green I 实时荧光定量PCR仪 梯度PCR仪 普通PCR仪 PCR示例 一、实验目的 学习PCR分析的原理与技术。 1、材料：含1Kb插入片段的克隆载体Pmd18-T 质粒DNA 2、仪器：微量移液器及吸头、PCR仪及PCR管 琼脂糖凝胶电泳设备 3、试剂：10XPCR 反应缓冲液 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10μmol/L 引物1和引物2 二、实验材料、仪器和试剂 * 农业生物学实验教学中心 * 生物化学实验技术 农业生物学实验教学中心 制作人：张杰道 多聚酶链式反应 （PCR：Polymerase Chain Reaction) Kary B. Mullis PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种 体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA 快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝 尔化学奖。 体内DNA的复制体系 DNA聚合酶（I II III） 拓扑异构酶 解旋酶类 SSB 引物 dNTP Mg2+ 5’ 3’ Mullis的PCR构思 引物 引物 DNA聚合酶 DNA聚合酶 特定DNA片段 Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 酶活性(%) 温度(℃) 40 50 60 70 80 90 100 100 80 60 40 20 耐热DNA聚合酶 Saiki（1988）将耐热DNA聚合酶引入PCR，使利用热变性解链DNA模板可行。 PCR反应循环 72℃ 94℃ 55℃ PCR循环 变性 退火 延伸 PCR的指数扩增（2n） 引物 延伸 延伸 5’ 5’ 3’ 3’ 变性、退火 变性、退火 Taq P1 P2 PCR反应体系 dATP dTTP dGTP dCTP Mg2+ 模板：DNA 引物：P1 P2 DNA聚合酶：Taq 原料：dNTP 反应缓冲液 辅助因子：Mg2+ 1）PCR反应成分 （1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 DNA模板一般100ng /100?L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 PCR反应条件 （2）引物浓度 0.1-0.5 ?mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 （3）Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 ?l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。 （4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。 （5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。适宜浓度为0.5-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。