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NDM-1基因的检测与确认 NDM-1简介 一个新发现的耐药基因,全长826bp 编码1型新德里金属β-内酰胺酶 造细菌成对碳青酶烯类药物耐药 位于质粒上 最初发现在肺炎克雷伯杆质粒pKpANDM-1上 Genbank FN396876 (2009.11.24) 具有可移动性 可在不同种属细菌间转移 革兰阴性:肠杆菌科、不动杆菌、假单胞菌 革兰阳性:?? E.coli Genbank AB571289 (2010.07.10) NDM-1的基因检测 PCR检测 序列测定──最终确认 检测对象: 已经过表型筛检的菌株进行NDM-1基因确认 对大批菌株直接进行筛检 对标本的检测 高通量、快速、准确 PCR检测方法──模板制备 模板制备:菌株、标本 菌株 (1)G-细菌: a. 水煮模板:新鲜培养物悬浊于100-200μl纯水 沸水浴10min以上 8000rpm以上离心5min 吸取上清,-20 ℃保存 b. 试剂盒提取基因组DNA(说明书) PCR检测方法──模板制备 菌株 (2)G+细菌: a. 试剂盒提取基因组DNA(说明书) 溶菌酶充分作用 b. 水煮模板:新鲜培养物悬浊于100-200 μ l纯水 低温反复冻融(-40 ℃以下或液氮) 沸水浴10min以上 8000rpm以上离心5min 吸取上清,-20 ℃保存 2. 标本:根据标本类型不同选择相应的试剂盒 PCR检测──引物选择 引物选择: PCR检测──PCR体系 引物合成稀释 冻干粉末,开启前10000rpm离心5min 小心开盖,防止粉末喷出 1.0OD+268 μ l纯水,充分震荡混匀 ,浓度20 μ M(20 μ mol/L) 20 μ l体系(右图) 若使用含有Mg2+的10×buffer的加入量同上表,MgCl2体积用水补齐 PCR Premix预混液(根据说明书) PCR检测──PCR体系 没有阳性对照,如何确保体系正常运转 同批 配置体系时:增加1管不使用NDM-1引物 加入常用引物及模板,扩增其他已知片段 人工合成长片段DNA作为阳性对照?? 不建议合成:首次发现时如何排除“污染”质疑 如果一定要合成:在中间区域加入若干数量的突变位点 作为区别合成片段与实际阳性片段的标志 PCR检测──PCR反应条件与电泳 反应条件:(约耗时1小时25分钟) 94℃ 5min 94℃ 15sec Tm℃ 30sec 25个循环 72℃ 30sec 72℃ 5min 电泳:1.5﹪琼脂糖电泳 marker:DL2000 基因序列测定──最终确认 PCR阳性结果:携带NDM-1基因 非特异扩增 最终确认:序列测定 测序公司,当天得到结果 测序样品:100 μ l以上PCR产物 引物及其浓度:上下游引物各10 μ l(20uM) 测序要求:双向、测通,提供拼接好的序列 基因序列测定──测序结果判读 测序彩图:峰体清晰、无套峰 基因序列测定──测序结果判读 双向测序结果拼接 基因序列测定──序列比对 下载参考序列: Genbank:FN396876.1 /nuccore/255031061 AB571289、HQ171206、HM853678 将测度序列与参考序列比对: 常用软件:Clustal、DNAstar、Mega…… NDM-1基因携带与耐药 抗生素敏感性──细菌表型特征 耐药基因正确表达,表现出细菌的抗生素敏感性 一种细菌可具有多种耐药机制 NDM-1只是其中一种 该细菌表现出的抗生素敏感性是各种耐药机制综合表现的结果 NDM-1基因的检测与确认──基于基因水平的判断