免疫组化基本原理操作流程及注意事项.ppt

多克隆抗体（PcAb)：利用已知抗原免疫动物后所获得的免疫血清中所提取的免疫球蛋白。1890年抗毒素的出现，标志着第一代抗体－多克隆抗体的产生。它的特异性相对低于McAb,但亲和力高。 单克隆抗体（McAb): 通过杂交瘤技术制备出的只针对一种抗原决定簇的抗体。1975年抗绵羊红细胞抗体的出现，标志着第二代抗体－单克隆抗体的产生。它特异性及纯度都比较高，但产量较低。 常用的免疫组织化学技术方法 免疫荧光技术（免疫荧光法） 免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、ABC法等） 免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染 色法等） 固定 标本的固定和组织处理 固定液、固定时间： 10%中性福尔马林；固定时间6-48H，细针 穿刺标本大于1H 组织处理条件：浸蜡、烤片温度不能高于 65℃ 分析中 每一种新抗体在应用于临床之前必须进行 实验验证 严格执行实验室的SOP 日常质控：抗原修复液的PH、抗原修复温 度等实验条件的质控 实验对照：阳性、阴性组织对照及阴性试 剂对照 抗体 Received接收 所有免疫组化试剂接收时均应标明接收日期，并在《免疫组化试剂登记表》上登记。 Storage储存 所有试剂均应在厂家指定或建议的温度下保存，储存试剂的冰箱应每天检查并记录温度。 Usage使用 所有试剂使用时均应标明开封日期，试剂应保证在有效期内使用，过期试剂应丢弃不用，并在《免疫组化试剂登记表》的“过期弃用时间”中注明。 Lable试剂标签 试剂和溶液的标签应包括以下要素：内容及质量、浓度或效价；储存要求；实验室配制的日期；有效期。以上要素应记录在《试剂配制记录表》中。 抗体存放 新购进的浓缩型干粉样抗体需分成若干份小剂量保存，避免反复冻融或开启造成抗体效价降低或污染。 分装的抗体需标明名称、批号、分装日期、有效期。小剂量的浓缩抗体则按照说明书的存储条件存放。 缓冲液（Buffer） 每一批新购进或新配制的缓冲液（包括修复液）都要使用PH仪认真检测其PH值，检测结果要记录在《缓冲液校准表》中， 缓冲液要定期检查溶液的PH值（至少每周一次）。特别是在日常质量控制中的某些抗体染色强度减弱原因不明，则必须重新检测缓冲液的PH值。 PH值不正确的缓冲液应弃去不用，重新配制合格的缓冲液，并在《缓冲液校准表》相应日期栏中注明其PH值及“弃用”字样。 免疫组化抗体的实验方法验证 免疫组化实验室将某种抗体用于病人的诊断之前，应对该抗体进行实验验证。 对于一个新的抗体，应该摸索其染色条件，保证有足够的实验批次来检测其敏感性和特异性。 验证实验 1、通过比较实验确定抗体滴度、抗原修复的方法 2、孵育时间以及缓冲液的类型、PH值等最适宜的实验条件， 3、结果的可重复性 4、同时通过多次的重复性检测来确定该试剂的敏感性和特异性。 这对于文献报道较少的抗体尤其重要。 通过实验确立最佳的抗体滴度、抗原修复条件以及其它辅助试剂的类型、浓度。 抗体的滴度 参考厂家推荐的抗体滴度并在前后各加设定一个实验滴度， 例如厂家推荐滴度为1：200： 那我们的验证实验滴度就设为A 1：100、B 1：200、C 1：400 通过验证至少三个滴度梯度来观察阳性细胞染色强度及非特异性染色，确后确定最佳滴度。 送检22个冰冻皮肤组织 20个石蜡包埋组织 合计21个病例，每个病例分别送检untreated、treated 合计42个蜡块 另送检三个正常皮肤组织蜡块，做阳性对照 由上海诺华CNIBR提供。 则选取十个不同个体的病例，（特殊病种可酌情减少个体病例）进行检测验证。 工作液：3-5个病例 乳腺癌：ER PR HER2 40个病例 免疫组化验证实验的过程必须详实地记录，操作步骤 应记录在《免疫组化抗体验证实验记录表》中。 最后由病理主任或指定的病理医生应对验证 《免疫组化抗体滴度及验证条件确定表》 所有实验室使用抗体验证结束后统计其抗体厂家、克隆号、实验滴度、抗原修复方法、实验组织类型、阳性率等填写在《免疫组化验证实验抗体一览表》中。 验证报告 批次验证 疫组化和特殊染色实验室每购进一批新抗体或特染试剂 应用适当的控制方法与旧抗体或试剂进行实验并比较实验结果 适当调整抗体的稀释度，以确保染色强度不发生太大改变。 比较的结果及抗体稀释度的改变需经病理主任或指定的病理医生观察确认和审批，并记录在《批次抗体比较结果》中。 新抗体才可以投入实验室常规使用。 扁桃体Tonsil, 应该包括上皮用于高分子Cytokaratin 和cyclin D1, 淋巴组织用于不同的白血球阳性对照 结肠组织， 作为cytokeratin 20 (结肠上皮), chromogranin (内分泌细胞), calretinin (ganglio