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　　分析荧光素酶基因转导及组织学变化 --分析荧光素酶基因转导及组织学变化 【摘要】　目的　观察大白鼠颌下腺腺病毒介导的荧光素酶基因转导及其组织学变化。方法　将40只VLuc,3d及1、2、4、8周后观察其基因表达及病理变化。结果　颌下腺转基因表达3 d时最高,以后逐渐下降,至4周、8周时仍可测到表达。组织病理学变化: 3 d~1周时可见腺泡受挤压,腺导管扩张;2周时部分腺泡轻度萎缩,腺泡间距离加大;小叶内及小叶间导管周围淋巴细胞呈灶状浸润;4周时可见有腺泡及腺泡腔结构变清晰;8周时腺泡、导管基本恢复正常,炎症不明显。超微结构变化:注入基因后3 d,腺泡和导管细胞内可见大量粗面内质网,粘液腺泡中粘液滴增多,融合成片;1周后,导管腔的微绒毛突起减少,胞质内可见线粒体显著增多;2周及4周,腺泡腔可见少量的微绒毛突起及细丝网状物。粘液腺泡中可见粘液滴。基底部可见粗面内质网,基底膜增厚。结论　本研究报道了腺病毒介导的大鼠颌下腺基因转导后的超微结构变化,提示腺体蛋白合成体系功能活跃。大鼠涎腺基因转导能产生生物活性蛋白,腺体有明显炎症反应。 【关键词】　大鼠 VLuc,美国NIH基因治疗实验室提供),载体经过293细胞系繁殖、纯化、浓度标定。此基因为国际常用的报告基因,能表达定量检测,敏感度高。 3·体内基因转导至唾液腺方法:所有的动物通过肌注3%戊巴比妥(1 mg/kg)麻醉。在病毒感染前肌注阿托品(0·5 mg/kg)以减少唾液的流率。病毒悬浮于稀释的buffer液(10 mmol/L Tris,pH7·4, 0·1 mmol/L MgCl2, 10%glycerol)中,通过特制细软管逆行性插管至颌下腺导管约3 mm深,按转导荧光素酶基因后3 d、1周、2周、1个月及2个月将40只动物随机分为5组,每组8只。每组中3只双颌下腺导入108pfu的AdCMVLuc 50μl,同时肌注地塞米松,按每只1 mg/d连续注射3 d;3只双颌下腺导入108pfu的AdCMVLuc 50μl;2只双颌下腺导入病毒稀释缓冲液50μl。 4·荧光素酶分析:通过荧光素酶分析仪(Promega, Madison, 208S型透射电镜观察。结果一、荧光素酶基因在颌下腺的表达转基因表达3 d时最高,以后逐渐下降,至4、8周时个别腺体仍可测到表达。由表1可见,注射地塞米松组在转导基因3 d及1周时基因表达较不注射地塞米松组明显增高。　　 二、组织学观察转基因后3 d,腺泡受挤压,腺导管扩张,小叶间血管内可见少量淋巴细胞和中性粒细胞; 1周,腺泡腔变窄小叶间的导管周围血管内可见少量淋巴细胞、浆细胞、嗜酸粒细胞;2周,部分腺泡轻度萎缩,腺泡间距离加大,可见小叶内导管坏死,导管闭锁。小叶内、小叶间导管周围淋巴细胞呈灶状浸润,还可见少量单核细胞、嗜酸粒细胞;小叶间的血管内、腺泡间可见较多淋巴细胞;4周,腺泡腔较前有所恢复。在小叶内导管旁有少量淋巴细胞和单核细胞;8周,腺泡、导管基本恢复正常,炎症反应消失。对照组注入50μl病毒稀释缓冲液,颌下腺导管、腺泡未见异常改变。 三、超微结构观察基因导入3 d,导管腔面微绒毛突起消失,可见中电子密度无结构物质,导管细胞内近管腔处可见分泌颗粒,胞质内有丰富的粗面内质网,其中,有的粗面内质网模糊、结构溶解,电子密度增高。导管细胞内线粒体增多,形态不规则,电子密度增高,线粒体嵴不易辨认。粘液腺泡中粘液滴增多,融合成片(图1)。浆液腺泡电子密度增高,胞质内可见内质网。腺泡腔内微绒毛少,腺泡腔内有中电子密度不规则块状物。 1周,导管腔的微绒毛突起减少,胞质内可见线粒体显著增多,分泌颗粒增加(图2)。内质网与基因导入3 d时相比明显减少;腺泡腔内微·绒毛消失,胞质内细胞器少,仅见粗面内质网、粘液滴。间质中血管扩张。基底膜清楚,有的部位基底膜消失、中断。腺泡细胞间、导管细胞之间可见指状突起。2周,导管腔可见少量微绒毛突起。细胞顶端近管腔处可见分泌小泡。导管细胞间有桥粒连接。胞质内可见结构清楚的线粒体;腺泡腔可见少量的微绒毛突起。粘液腺泡中可见粘液滴。粗面内质网位于基底部。细胞间隙增宽。4周,导管腔及腺泡腔可见微绒毛突起(图3)。细胞间可见指状突起,微绒毛突起减少。对照组:导管的管腔面有少量微绒毛,导管细胞胞质内可见散在大小不等的分泌颗粒。还可见线粒体、核糖体等。腺泡腔面短的微绒毛突起,基底部可见细胞膜皱褶。腺泡细胞的胞质内可见大小不等、形态不一致的酶原颗粒及高尔基复合体、粗面内质网、线粒体,还可见少量核糖体。讨论腺病毒作载体能有效地转导基因,但不能使转基因在体内长期表达。主要原因是机体对其产生较强的免疫反应[6-8]。Adesanya等[9]及David等[10]用腺病毒介导的β-gal基因转导入大鼠颌下腺,观察到感染腺体内的炎症反应是病毒剂