嗅鞘细胞移植促进急性脊髓损伤修复实验研究.ppt

嗅鞘细胞移植促进急性脊髓损伤修复的实验研究 前言 嗅鞘细胞（OEG）是存在于嗅觉系统的一种特殊胶质细胞。实验证实OEG可以通过分泌多种因子，促进脊髓损伤的再生，同时在脊髓损伤段又为再生神经纤维形成髓鞘。 实验目的 研究OEG对脊髓急性挫伤加横断 伤的修复作用。 一．材料与方法（一）OEG的培养 取新生Wistar大鼠嗅球（OB），消化后吹打成单细胞悬液，以1×104/ml接种于DF-12S中，在37℃、5%CO2 孵育。?接种细胞在D/F-12S培养三天后，换无血清纯化培养液。并且每3-4天换液一次，细胞长满后传代。 （二）标记OEG 用Hoechst标记经过纯化培养7-10天的OEG 细胞，并将细胞浓缩到50，000个/μl 。 （三）实验分组 四月龄Wistar雌性大鼠50只，随机分为三个组，A、 B组各20只， C组10只。 A组 脊髓挫伤+横断+移植OEG B组 脊髓挫伤+横断+注射DMEM C组 单纯椎板切除 （四）后肢运动功能测试 所有手术动物分别在术后2周、4周、6周、8周、10周、12周，做后肢BBB运动功能21分测试。 （五）组织学检查 术后3个月取材，分别做Hoechst标记细胞的观察、 HE染色、嗜银染色和抗NF免疫组化染色。 结 果（一）原始培养细胞形态 OEG原代培养第4天，未染色?100 （二）纯化培养后细胞形态 经纯化培养7天的OEG，未染色?100 （三）后肢运动功能测定结果 不同时间各组运动功能BBB得分均值 （四）Hoechst标记的OEG 在体内的特点 A组3号损伤段纵切，荧光?40 （五）组织学观察  1.??? HE染色结果 A组9号损伤段纵切， HE?40 B组14号损伤段纵切， HE?40 2.??? 嗜银染色结果 A组17号损伤段纵切，嗜银?200 B组16号损伤段纵切，嗜银?200 A组14号损伤近端横切，嗜银?200 B组1号损伤近端横切，嗜银?200 3.免疫组化抗NF染色结果 A组6号损伤段纵切， NF ?200 B组4号损伤段纵切， NF?200 A组2号损伤近端横切， NF ?200 B组20号损伤近端横切， NF ?200 （七）神经纤维计数和图象分析 根据NF染色和嗜银染色结果，利用图象分析系统对CST内神经纤维进行计数。  A、B组损伤近端和C组相同节段神经纤维计数 三. 讨 论 （一）OEG促进脊髓损伤 神经再生的机理 1. 包裹神经纤维，避免了与抑制因素相接触。 2. 分泌NGF、BDNF、NT-3和NT-4等因子，促进神经的生存、分化、成熟和再生，使成年动物保持了神经纤维再生的能力。 3. 能够产生一种含有硫酸软骨素的酶，降解胶质瘢痕产生的化学抑制因子。 （二）OEG移植后运动功能 和组织学改变（1） BBB运动功能评分是客观反映大鼠运动功能的一项评分标准，可以间接反映脊髓损伤的恢复情况。 本实验OEG移植组BBB评分明显高于注射DMEM的对照组，说明OEG移植确有促进脊髓功能恢复的作用。 （二）OEG移植后运动功能 和组织学改变（2） OEG移植组神经纤维数量明显多于注射DMEM的对照组，说明OEG有促进脊髓损伤神经纤维再生的作用。由于其数量明显少于单纯椎板切除组，说明这种促进再生的能力又是有限的。 结 论? 1．利用新生大鼠OB做OEG培养方法 简单，增殖迅速。2．无血清纯化培养可以得到纯度相对较 高的OEG。 3. 可以利用OEG 的GFAP和P75免疫染色 双阳性的特点做细胞鉴定。 4. OEG移植有明显促进急性脊髓挫伤加横断 伤神经纤维再生和运动功能恢复的作用。  谢 谢 * * 19.5±1.08 0 0 2周 21±0 21±0 21±0 20.9±0.32 20.2±0.79 C组 3.78±0.94 3.33±1.03 2.28±0.89 1.00±0.60 0.56±0.51 B组 10.39±1.04 9.17±0.86 5.83±0.86 3.06±0.64 1.11±0.47