小鼠SOIX基因重组等实验设计.docVIP

中央民族大学生命与环境科学学院 分子生物学实验期末实验设计 小鼠SOIX基因的重组实验设计 pGEM?-T Easy 载体 说明 pGEM?-T Easy 载体系统是克隆PCR 产物的方便系统。它除了具有pGEM?-T 载体系统(Cat.# A3600, A3610) 所有的优势外，在插入位点两侧分别有EcoRI 和NotI 酶切位点，便于通过选择单酶切释放插入的DNA。pGEM?-T Easy 载体系统II 除了pGEM? -T Easy载体系统I 所有成分外，还包括JM109 感受态细胞 特点 灵活：pGEM?-T Easy 载体多克隆位点两侧分别有BstZI, EcoRI和NotI 酶切位点，便于通过选择单酶切释放插入的DNA。 快速连接：使用2X 快速连接缓冲液(2X Rapid Ligation Buffer)可以使连接反应在室温下1 小时内完成。 .蓝/ 白筛选：载体包含有T7 和SP6 RNA 聚合酶启动子，分别位于β - 半乳糖苷酶的α - 肽编码区内多克隆位点的两侧。α - 肽的插入失活允许在指示培养基上用颜色直接筛选重组克隆。 .f1 复制起始位点：可用于制备单链DNA。 4. 至此确定引物分别为： 上游引物P1：5’—TAAGCTTATGFACAGCATGATGATGGAG一3’，（含ApaI酶切位点，GGGCCC） 下游引物P2：5’一GGAATFCCTAGATGTGCGTCAGGGGCAC一3’（含SphI酶切位点，GCATGC） 引物可以找公司合成。 具体实验步骤 总体实验流程图 Trizol法提取小鼠目的基因mRAN RT-PCR扩增目的基因和基因测序与确认 感受态细胞的制备 质粒DNA的提取及浓度测定 重组蛋白表达及目的蛋白的免疫印迹鉴定 图1 实验设计流程图 目的基因提取 1.实验前准备 材料：孕育第8天的小鼠 设备：研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。 试剂： （1）无RNA酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃ 2小时）装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 （2）75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 （3）1×层析柱加样缓冲液；20mmol/L Tris·Cl(pH7.6)，0.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1% SDS。 （4）洗脱缓冲液：10mmol/L Tris·Cl (pH7.6)，1mmol/L EDTA (pH8.0)，0.05% SDS。 2.操作步骤 (1)小鼠总RNA的提取 Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。孕第8天的小鼠用断颈法处死后在无菌条件下取其胚胎组织。 将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。 研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。 取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。 弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。 小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶 10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。 [注意] 整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。 加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。 （2）小鼠mRNA的提取 由于mRNA末端含有多poly(A)+，当总RNA流径oligo(dT)纤维素时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT) 纤维素柱，可得到较纯的mRNA。 用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。 将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0m