第二十一章 常用分子生物学技术原理及应用.ppt

1. 比较患者基因组DNA与正常人基因组DNA的不同，直接对产生变异的DNA片段进行克隆。 表型克隆的策略： 2. 针对已知候选基因。比较患者和正常对照间候选基因表达的差异来确定该基因是否为该疾病相关基因。 针对未知基因常用的技术有 mRNA差异显示（mRNA differential display，mRNA-DD） 抑制消减杂交（suppressive substractive hybridization，SSH） 基因表达系列分析（SAGE） cDNA微阵列 （cDNA microarray） 基因鉴定集成法 （integrated procedure for gene identification） 3. 针对未知基因的，比较疾病和正常组织中的所有mRNA的表达种类和含量间的差异，克隆候选基因。 （三）采用动物模型克隆疾病相关基因 人类的部分疾病，已经有相应的动物模型。如果动物某种表型的突变基因定位于染色体的某一部位, 而具有相似人类疾病表型的基因很有可能存在于人染色体的同源部位。 另外，当疾病基因在动物模型上已完成鉴定，还可以采用荧光原位杂交来定位分离人的同源基因。 二、定位克隆是鉴定疾病相关基因的经典方法 定位克隆（positional cloning）：仅根据疾病基因在染色体上的大体位置，鉴定克隆疾病相关基因。 定位克隆的起点是基因定位，即确定疾病相关基因在染色体上的位置，然后根据这一位置信息，应用DNA标记将经典的遗传学信息转换为遗传标记所代表的特定基因组区域，再以相关基因组区域的相连重叠群 （contig） 筛选候选基因，最后比较患者和正常人这些基因的差异，确定基因和疾病的关系。 （一）基因定位的方法 1．体细胞杂交法通过融合细胞的筛查定位基因 2．染色体原位杂交是在细胞水平定位基因的常用方法 3. 染色体异常有时可提供疾病基因定位的替代方法 4．连锁分析是定位疾病未知基因的常用方法 （二）定位克隆的基本程序包括三大步骤 1．尽可能缩小染色体上的候选区域 2．构建目的区域的物理图谱 3. 疾病相关基因的确定 杜显氏肌肉萎缩症（Duchenne Muscular Dystrophy, DMD），又称杜氏肌肉萎缩症，是一种性联隐性遗传病，又名为假性肥大型肌肉萎缩症，为症状最严重的肌肉萎缩症。大约65%的病例是经由性染色体隐性遗传而来；35%的病例则由于基因突变而来。 （三）假肥大型肌营养不良基因的克隆是定位克隆的成功例证 死于杜兴氏肌肉营养不良症患者的腓肠肌病理组织切片，其肌肉纤维被脂肪细胞所取代。 步伐不稳、容易跌倒、不良于行（跑步和跳）、行路能力通常在12岁时消失、容易疲劳、轻度智能障碍（大概30%的患者）、骨骼发育畸形（有些个案为脊椎侧弯）、肌肉发育畸形、小腿肌肉异常肿大 初期症状 晚期症状 杜兴氏肌肉营养不良症最终会影响到所有平滑肌，以及心脏和呼吸肌肉。患者很少能活过35岁。??患者一般由于呼吸衰竭或心功能紊乱而死亡。 首先，根据患病女性X染色体与第21号常染色体的易位，以及男患儿发生小的Xp21.2缺失并伴发三种其他X连锁隐性遗传病，再运用RFLP连锁分析将DMD基因定位于Xp21。 然后，分别克隆得到了基因的2个不同的片段，分别命名为XJ系列探针和pERT87系列探针，根据两片段的比较，证明DMD基因约为2300 kb，占X染色体的1%以上，该基因编码肌营养不良蛋白（dystrophin），影响横纹肌和心肌的结构和收缩功能。 易感基因的克隆 三、确定常见病的基因需要全基因组关联分析和全外显子测序 全基因组的关联研究（genome-wide association study, GWAS）指在全基因组层面上，通过对大规模的群体DNA样本进行全基因组高密度遗传标记分型，从而寻找与复杂疾病相关的遗传因素的研究方法，全面揭示疾病发生、发展与治疗相关的遗传基因。 全外显子测序（whole exon sequencing） 全外显子组测序法是分析基因组的一种更便宜、更快速但有效的策略. 四、生物信息数据库贮藏丰富的疾病相关基因信息 人类基因组计划和多种模式生物基因组测序的完成, 生物信息学的发展, 计算机软件的开发应用和互联网的普及，人们通过已获得的序列与数据库中核酸序列及蛋白质序列进行同源性比较，或对数据库中不同物种间的序列比较分析、拼接，预测新的全长基因等，进而通过实验证实，从组织细胞中克隆该基因，这就是所谓的电子克隆 （in silico cloning）。 第三节 疾病相关基因的功能研究 基因的功能实际是编码蛋白质或非编码基因RNA。 基因的功能可以从三个水平来描述： ① 生物化学水平，基因产物的生化功能； ② 细胞水平, 基因产物参与的细胞活动； ③