分子生物学--定点诱变和蛋白质工程 .ppt

第九章 定点诱变与蛋白质工程 山东大学医学院生物化学 与分子生物学研究所 刘贤锡 蛋白质在生命现象中具有重要作用，在医药、轻工等行业也具有重要作用，如胰岛素、枯草杆菌蛋白酶等； 天然生物材料中蛋白质含量较少； 基因克隆技术克隆基因，在宿主细胞中可表达特定蛋白质（重组蛋白）； 多数天然蛋白质的理化特性不能适应于工业用途; 利用现代分子生物学技术，改变克隆基因中的特定基因，即可表达出适合于商业用途的蛋白质。 在体外，通过碱基取代、插入或缺失的方法，使基因DNA序列中的某个特定碱基发生改变，从而改变蛋白质的结构，称为蛋白质工程。 通过蛋白质工程，人们可以随心所欲地改变蛋白质的结构及其理化性质和生物学功能。例如，我们可以利用蛋白质工程改变酶的Km、Vmax，酶促反应的最适温度、最适pH值、酶促反应的特异性以及酶蛋白的稳定性等。 蛋白质工程的主要技术之一是定点诱变技术. 第一节 定点诱变 一、定点诱变的概念 利用分子生物学技术，在体外通过碱基取代、插入或缺失可以使基因DNA序列中任何一个特定的碱基发生改变。这种体外特异性改变某个碱基的技术，称谓定点诱变（site directed mutagenesis）。 定点诱变具有简单易行、重复性高等优点，现已发展成为基因操作的一种技术。这种技术不仅适用于基因结构与功能的研究，还可通过改变基因的密码子来改造天然蛋白质。 二、基因定点诱变的意义 用于研究基因的结构与功能； 通过改变基因的密码子来改造天然蛋白质，使其更符合人们的需要。如酶蛋白的改造以及新型疫苗或药物的开发。 如枯草杆菌蛋白酶之所以易被氧化失活，是由于催化部位的丝氨酸(Ser221)邻近的甲硫氨酸(Met222)易被氧化成硫氢化物，若以其他氨基酸取代Met222，则可提高酶的氧化稳定性而又不影响其催化活性。这是结构分析和定点突变改造蛋白质的成功范例。 枯草杆菌蛋白酶可作为洗涤剂的添加剂，但由于其只能水解苯丙氨酸(Phe)羧基所形成的肽键，底物作用范围过窄而限制了洗涤剂的高效性，若用带正电荷的赖氨酸(Lys)取代位于活性中心166位的甘氨酸(Gly)，所获得的突变酶不仅能水解苯丙氨酸(Phe)羧基所形成的肽键，而且可以水解酸性氨基酸谷氨酸(Glu)所形成的肽键，使其底物作用范围拓宽，因而可能成为最高效的洗涤剂添加酶，这是定点诱变改变蛋白质生物学活性的成功例子。 N端-----------笨丙-天冬-----------谷-甘-------------- C端 多肽链 三、定点诱变的原理 定点诱变原理示意图 The Nobel Prize in Chemistry 1993 四、定点诱变的常用方法 （一）M13DNA寡核苷酸诱变 基因工程中,噬菌体是一种常用的基因载体,其中又以M13 和λ为最常用。 M13噬菌体是一种环形DNA，基因组大小为6.4kb，在颗粒中包装的仅是正链的DNA，有时也称为感染型单链DNA(single stranded DNA, ssDNA) 。 当感染型单链M13噬菌体感染大肠杆菌后，在菌体内借助宿主的酶系统先把ssDNA复制为双链（dsDNA），称为复制型（replication form,RF）M13（RF- M13）。 广泛用于DNA序列分析和噬菌体表面展示系统（phage display)和单链核酸的制备。 单链丝状噬菌体(M13噬菌体) 1.基本原理： 寡核苷酸定点诱变技术所依据的原理是: 首先制备单链核酸,即按体外DNA重组技术，将待诱变的目的基因插入到M13噬菌体上，制备此种含有目的基因的M13单链DNA，即正链DNA。 再使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段作引物，启动M13单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为新合成的DNA子链的一个组成部分。 因此所产生的新链便具有已发生突变的碱基序列,将其转入细胞后,经过不断复制,即可获得突变的DNA分子,再经表达即可获得改造后蛋白质. 为了使目的基因的特定位点发生突变，所设计的寡核苷酸引物的序列除了所需的突变碱基外，其余的则与目的基因编码链的特定区段完全互补。 2.诱变过程 1)合成含有目的 基因的正链DNA； 2)合成含有特殊 突变碱基的引物； 3）制备异源双链 DNA（右图）； 4）富集和转化双 链DNA分子； 5）筛选突变体并鉴定 （二）Kunkel定点诱变法 体外DNA合成往往是不完全的，所以部分合成的DNA分子必须通过蔗糖密度梯度离心除去,获得纯化的突变DNA。 理论上来说，DNA是半保留复制的，应用寡核苷酸定点诱变时，所