第十章 动物组织和胚胎工程2011.ppt

囊胚注射法把某些种类细胞注射入囊胚的囊胚腔中，注射的细胞可以是卵裂球、内细胞团细胞、胚胎干细胞，甚至是已经分化的细胞。若注入的细胞参与胚体的形成，那么就形成了嵌合体。注射时，选取健康、生长良好的细胞。如果是培养细胞，应该保证其整二倍体性。将10－12个细胞吸入到注射吸管的顶端。用固定吸管吸住内细胞团与滋胚层交界处，让内细胞团位于囊胚的底部位置。调整注射吸管与固定吸管使处于同一焦点平面，选择滋胚层细胞间的“间隙处”，将注射吸管插入囊胚腔。将细胞推入囊胚腔，使之落到内细胞团之上。操作后的囊胚形态不规则，经短期培养后，可以恢复正常状态。 有色鼠与白色鼠胚胎融合 胚胎嵌合的鉴定两种：色素分析法和遗传分析法色素分析法简单、直观，比较实用。一般选用肤色、毛色差异明显的动物的胚胎作为供体胚，如用白鼠或黑鼠。幼鼠生下4－5天后，就可以分析其肤色或毛色，怀孕10天左右的小鼠胎儿，眼睛就有色素沉积。或者在出生时，检查眼睑色素情况，确定是否是嵌合体。 使用同工酶分析 首先分析动物特定的同工酶谱系，然后选择具有不同图谱的两种或多种动物作为供体动物提供胚胎。 如果获得的动物是嵌合体，那么同工酶谱中应显现与供体动物相对应的特定谱带，不同品种动物的同工酶均有表现。 现在比较常用的是磷酸葡萄糖异构酶（GPI）分析，其原理是果糖－6－磷酸在GPI作用下，产生葡萄糖－6－磷酸，在6－磷酸葡萄糖脱氢酶和NADP作用下，使G－6－P成为6－磷酸葡萄糖酸盐，NADP还原为NADPH。经GPI染液染色，可显示出同工酶谱带。 分析时，从嵌合动物中取不同组织器官，匀浆后制成电泳样本，在醋酸纤维素板上点样，电泳、染色处理。与标准的同工酶谱对照，鉴定是否是嵌合体。 胚胎嵌合的意义胚胎嵌合技术可以作为研究分析哺乳动物发生机制的重要手段，例如研究卵裂球分化潜力，研究性分化机制与性比，研究X染色体失活及其作用和研究胚胎细胞基因表达的机制；也可以对生理功能分析的应用，例如对免疫功能、遗传病的研究分析；还可以培育杂种个体，甚至是种间杂种；可以通过制作各种组合的嵌合体，培育新的毛皮动物；利用种间移植，分析胎儿和母体的相互关系。 三、胚胎分割 １、胚胎分割的原理 根据卵裂球具有发育成为一个个体的全能性的特点，人们就考虑用这种实验技术，生产同卵双胎或多胎，以加速优良种群的繁殖。 胚胎的分割在不同时期有不同的分离培养方法，如卵裂球分离培养法、致密化前各期胚胎分割法、桑椹胚至囊胚期胚胎分割法等。 同卵双生 ２、卵裂球分离培养 卵裂球分离培养是将桑椹胚以前的卵裂胚去掉透明带，分离每个卵裂球，将其包埋于琼脂中，将包有卵裂球的琼脂柱，移到中间受体小鼠或兔的输卵管中，经数日活体内培养后，再取出已经发育到多细胞的胚胎，移于受体子宫。 这种方法已经在牛、羊、马生出同卵多胎。 对研究卵裂球位置与分化方向以及研究嵌合胚、不同卵裂球遗传性等，都是一种很有用的技术。 ３、致密化以前各期的胚胎分割 对于致密化以前各期的胚胎，由于卵裂球之间彼此尚未建立起紧密联系，分割时较容易进行。根据胚胎的直径，制作适宜口径的固定吸管和吸取卵裂球用的微吸管。在显微操作仪上，用固定吸管固定住胚胎，然后用微玻璃针自上而下切开透明带，使其成为一个切口。将微吸管自切口处伸入，吸住半数卵裂球，慢慢取出，这样即可以把胚胎一分为二。把吸出的半胚或卵裂球，纳入空透明带中。空透明带是将废弃的卵母细胞或不合适的胚胎，去除其内容物即可。然后将分割后的胚胎包入琼脂柱，通过中间受体培养。依照同样的方法，可以将胚胎分割成为四或八分胚。 ４、桑椹期的胚胎分割 用微玻璃针或微刀进行分割，无需固定吸管，由于透明带韧性较强。 切割之前需要对其进行软化处理，处理标准是：4－8细胞胚胎用0.5％酶液处理1－2分钟；桑椹胚用0.2％－0.3％酶液处理30秒钟；囊胚则用0.2％－0.3％酶液处理30秒以下。 ５、过程 把经过软化处理的胚胎，与少量培养液一起置于载片上，把针或微刀的刃部调节到胚胎的正上方。然后自胚胎的等分线向下移动，把胚胎轻轻压住，继续下切，胚胎就被压扁，继而被切开。再把切割的胚胎纳入空透明带。 囊胚切割时，需将内细胞团一分为二，早期的囊胚的二分胚发育率，比桑椹胚的二分胚发育率要低，可能是因为囊胚正处于进一步的细胞分化状态，操作后胚胎的调整能力比桑椹胚差。相对而言，二分胚、四分胚比较容易培养，而八分胚的存活率很低。 过程 胚胎分割 * * * * 体外胚胎生产(in vitro production，IVP) 活体采卵（ovunl pick－up，OPU） * 供体羊胚胎收集 黄体 收集到的冲洗液静置，冲洗液分离。 拣胚：将胚胎移至培养液或保存液中。 胚胎鉴定：根据透明带、胚胎细胞、发育阶段及细胞在透明带中的比例确定胚胎级别。 5.胚胎的