免疫学实验课件分子生物学技术 2015.ppt

1. 从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。5. 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。 基因工程的主要内容或步骤: 限制-修饰体系——由限制性内切核酸酶与甲基化酶组成 限制性内切核酸酶 EcoRI 5’-G↓AATT C-3’ 3’-C TTAA ↑ G-5’ PstI 5’-C TGCA ↓ G-3’ 3’-G ↑ ACGT C-5’ HpaI 5’-GTT ↓ AAC-3’ 3’-CAA ↑ TTG-5’ ampr terr ori EcoR I pBR322 质粒DNA 病毒DNA 载体—— 噬菌体DNA YAC（酵母人工染色体） 自我复制 克隆位点 选择标志 谢谢！ 当你进入实验室时，要像脱去外衣那样放下你的想象力，因实实验操作中不能有一丁点儿的想象。否则，你对事物的观察就会受到影响。当你翻开书本的时候，你又必须尽可能展开想象的翅膀，否则，你就不可能走在别人的前面。 * * 核酸的凝胶电泳 自 从 琼 脂 糖 （ agarose ） 和 聚 丙 烯 酰 胺 （polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来， 按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经 发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质 与核酸相互作用的重要实验手段。 * 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb 之间。 聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基 对之间。 凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓 度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。 * 由 于 插 入 了 溴 化乙 锭 分 子 ， 在 紫外 光 照 射 下 ， 琼脂 糖 凝胶电泳中DNA的 条 带 便 呈 现出 橘 黄 色 荧 光 ，易 于 鉴定。 * 通过细菌转化方法将体外构建好的杂种DNA分 子导入宿主细胞中。外源DNA通过自身载体上 的复制起始点进行复制增殖，能在宿主细胞中 长期保存下来，并能以完整的形式从细胞中被 分离纯化出来。 细菌转化（transformation），是指一种细菌 菌株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性 状特征发生遗传改变的过程。提供转化DNA的 菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株 则被称为受体菌株。 * CaCl2 的诱导原因： 在0℃的CaCl2 低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀， Ca 2＋使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中部分核酸酶解离，诱导形成感受态。 Ca 2＋ 能与加入的DNA分子结合，形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物，黏附在胞膜的外表面；42 ℃热激处理，细胞膜的液晶结构发生扰动，出现间隙。 * TAIL-PCR（Thermal Asymmetric InterLaced Polymerase Chain Reaction） 热不对称交错多聚酶链式反应。常用于扩增TDNA插入位点侧翼序列，从而获得转基因植物 插入位点特异性分子证据。TAIL-PCR使用一套巢式（nested）特异引物 （T-DNA边界引物，TR）和一个短的随机简并 引物（AD）。 第一轮反应（Primary reaction）是TAILPCR的重要环节，先进行5轮高严谨性循环， 特异性引物与模板退火，只能发生单引物循环， T-DNA上游侧翼序列得到线性扩增。大幅度降低退火温度，使AD及TR均与模板 DNA相结合，指数扩增一个循环。 此后，两个高严谨、一个低严谨循环交替进行， 共15个循环。特异性序列（两端分别拥有TR1 和AD序列）和非特异性序列I（只有TR1，没 有AD序列）大大超过非特异性序列II （两端均 为AD序列）。PCRII中，特异性序列再次被优先扩增，经稀 释的非特异性序列I也已大为降低，此时已没明显的背景片段了。 PCRIII是真正意义上的PCR，共20个循环， 进一步扩增特异性序列。TAIL – PCR 反 应流程TAIL-PCR主要用于分离毗邻已知序列未知 DNA序列