免疫学新技术的原理及应用课件.ppt

免疫学新技术的原理及应用 内容 流式细胞仪技术 免疫磁珠分离技术（MACS） MHC多聚体 流式细胞成像技术 流式细胞仪 组成 液流系统 光学系统 电子系统 荧光染料的特性 激发光源与荧光标记物 应用： ◆ 细胞膜：流动性、膜电位、膜通透性。◆ 细胞内离子浓度：H+、Na+、K+和Ca2+。◆ 细胞周期：全周期分析、S期分析、M期分析。◆ 细胞表面蛋白质分析：免疫细胞分型、其它表面蛋白分析。◆ 细胞功能：如凋亡、抗药性。◆ 基因表达：内源及外源基因表达。◆ 细胞分选：◆ 细胞克隆 免疫磁珠分离技术（MACS） 磁性微球 免疫磁性微球 磁性纳米材料 1 磁性纳米材料的制备与性能 常用的磁性材料 三氧化二铁、四氧化三铁、铁钴合金等 较好的磁响应性 采用适当的方式可以得到纳米磁性材料 取一定量的磁性材料分别溶于适量的蒸馏水中，过滤后混合，加入一定量蒸馏水稀释，搅拌均匀，加入适当的表面活性剂作为分散剂。在一定温度下，保持搅拌，以一定速度向体系中加入溶液，滴加完后继续搅拌半小时。取出，放置于磁铁上，使氧化铁颗粒沉降，除去上层清液，再加入分散剂的水溶液适量，用超声波分散，过滤，即得氧化铁磁性纳米粒的色胶体溶液。 1 磁性纳米材料的制备与性能 碱液的浓度对氧化铁纳米粒的性能影响大 碱液浓度低则磁性材料的磁化强度就低； 碱液的滴加速度影响磁性材料的性能 滴速越慢，则磁性材料的粒度越小，磁化强度越低； 体系的反应温度也有影响 温度高则粒度变大，磁化强度增强。 1 磁性纳米材料的制备与性能 磁性纳米材料用水适当稀释后 可摄制电镜照片，经图象分析仪测定粒度的大小与分布 或用激光粒度测定仪直接测定，可以获得大小不等的纳米材料，最小可获得平均粒度为几个纳米的磁性材料，粒度一般呈正态分布 还可用X衍射测定仪分析磁性纳米材料的结构，用磁强计测定其磁化强度。 2? 用磁性纳米材料制备磁性微球 磁性纳米粒和高分子骨架材料 高分子材料 聚苯乙烯、硅烷、聚一烯、聚丙烯酸、淀粉、葡聚糖、明胶、白蛋白、乙基纤维素等。 有天然的也有合成 可以单独应用也可以合用 这些骨架材料应该性质稳定、强度较高、无毒副作用。 2? 用磁性纳米材料制备磁性微球 可分为一步法和二步法： 一步法是在成球前即加入磁性纳米材料，成球时聚合物将其包裹于其中； 二步法是先制备非磁性小球，然后通过处理使磁性材料进入其中，最后磁性纳米粒以分散的形式存在微球的骨架材料中。 3? 免疫磁性微球的制备、性能与作用原理 （1）免疫磁性微球的制备 免疫磁性微球（Immunomagnetic Microspheres，IMMS） 或免疫磁珠（Immunomagnetic Beads，IMB） 表面结合有单克隆抗体 要求所用的磁性微球能通过其表面的化学基因与单抗结合，或有较大的表面吸附力能与单抗牢固结合 交联聚苯乙烯微球强度高，表面易进行化学修饰，是比较理想的制备免疫磁性微球的骨架材料。 3? 免疫磁性微球的制备、性能与作用原理 微球与抗体的连接 吸附结合 依靠微球表面对抗体的非特异吸附力 只有在微球具有非常大的表面积时才有可能比较牢固 通过对其表面进行处理来提高它的抗体结合力，以保证IMMS表面有足够的抗体 共价结合 共价结合依靠微球表面的活性基团与抗体共价反应 如果微球表面有活性基团，就会通过较慢的化学反应共价结合在磁性微球的表面。 3? 免疫磁性微球的制备、性能与作用原理 （2）免疫磁性微球的作用原理? 主要用于细胞分离 可以通过抗原抗体反应选择性地与靶物质结合，当此化合物通过一个磁场装置时，与免疫磁性微球结合的靶物质就会被磁场滞留，从而与其他复杂物质分离开来。 3? 免疫磁性微球的制备、性能与作用原理 （3）免疫磁性微球的性能? 化学性能稳定，不产生凝聚； 不与细胞发生非特异性的结合； 磁性微球与抗体的结合牢固； 磁性微球的大小均匀，磁响应性好，磁性纳米材料的含量均匀一致； 磁性微球大小适当，不易被细胞所吞噬。 3? 免疫磁性微球的制备、性能与作用原理 （4）免疫磁性微球与细胞的结合方法 直接法 抗体直接连在磁性微球上，然后与靶细胞结合 可以减少洗涤和培养步骤，但对IgM单抗很少能使用。 间接法 先使特异抗体结合在细胞表面，然后加入预先用抗鼠IgG（二抗）处理的磁性微球。 间接与靶细胞结合 适当范围广外，还可以使用一组单克隆抗体，因而会获得更好的细胞清除效果 但要经过多次的洗涤步骤，特异性也会有所降低。 3? 免疫磁性微球的制备、性能与作用原理 （5）免疫磁性微球分离法与其他方法比较 流式细胞仪技术（FACS） 昂贵、技术复杂、分选细胞活性和无菌度 表面联上二抗的异体红细胞花环技术 无法处理大量的细胞；尚无一成熟、简便的方法能够将抗体偶联至红细胞膜上