miR—200c在肝细胞癌组织中表达及其临床意义.docVIP

miR—200c在肝细胞癌组织中表达及其临床意义 　　[摘要] 目的 研究miR-200c在肝细胞癌组织中的表达并探讨其临床意义。方法 收集肝细胞癌手术组织标本52例，30例癌旁正常组织作为对照，采用qRT-PCR检测肝细胞癌组织及对照组织中miR-200c的表达情况，分析miR-200c表达水平与肝细胞癌临床病理参数之间的关系。结果 肝细胞癌组织中miR-200c平均表达量明显低于癌旁对照组织，差异具有统计学意义，癌旁对照组织中miR-200c平均表达量约为肝细胞癌的2.90倍。miR-200c的表达水平与肝细胞癌恶性程度、肿瘤分化程度以及AFP表达有关，miR-200c的表达水平与肝细胞癌患者年龄、性别、HBsAg、肿瘤大小、是否合并肝硬化等无关。多元Logistic回归模型分析发现，肿瘤大（OR=2.44，95%CI：1.22～10.36）、血清AFP 高（OR=2.39，95%CI：1.78～5.34）、肿瘤分化程度低（OR=3.08，95%CI： 2.29～6.03）是肝癌发病的独立危险因素。结论 miR-200c与肝细胞癌的发生、临床进展密切相关，它可能是肝细胞癌新的潜在的治疗靶点及诊断预后分子标志物。 　　[关键词] 肝细胞癌；miR-200c；临床进展 　　[中图分类号] R735.7 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）28-0001-03 　　miRNA 是一种包含21～25 个核苷酸的内源性非编码小RNA。miRNA由高等生物基因组编码，通过5’端被称为种子序列的7 nt序列与位于靶mRNA 3’UTR的 miRNA调控元件相互作用，识别靶mRNA，引导沉默复合体降解mRNA或阻碍其翻译，从而参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动[1-4]。研究表明，miR-200c在乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞中表达下调[5-6]。miRNA-200c通过抑制ZEB1来增强RASSF1A表达，进而抑制乳腺癌细胞的表皮细胞向间质细胞转化过程[7]。这些结果提示，miR-200c表达下调可能在肿瘤的发生发展中具有重要作用。但目前miR-200c在肝细胞癌的生物学功能并不清楚。本研究通过qRT-PCR技术检测miR-200c在肝细胞癌组织与癌旁对照组织中表达情况，并探讨miR-200c与肝细胞癌临床分期、转移等临床参数之间的关系，从而为进一步揭示肝细胞癌发病机制和寻找新的诊断及预后分子标志物提供实验依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 标本收集 　　52例肝细胞癌标本均取自于郴州市人民医院2009年1月～2011年10月肝细胞??患者手术标本和30例癌旁对照标本（距离癌组织边缘3cm以外），组织立即置于液氮保存。所有组织标本均经病理学诊断证实为肝细胞癌。手术前未接受化疗，且获得患者知情同意书。 　　1.2 RNA提取、逆转录 　　常规Trizol试剂抽提总RNA，无酶水溶解沉淀。紫外分光光度计测定RNA提取液的A260及A280吸光度值，检测RNA纯度和浓度。 　　逆转录反应按转录miRNA逆转录试剂盒（上海吉玛生物技术有限公司）说明书进行。反应体系：5×RT缓冲液4 μL、1 μmol/L miRNA特异性RT引物1.2 μL、25 mmol/L镁离子3 μL、10 mmol/L dNTP 0.75 μL、40 U/μL RNA酶抑制剂 0.25 μL、200 U/μL MMLV逆转录酶0.2 μL、RNA 1 μg，用无酶水补至20 μL。反应条件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 10 min。 　　1.3 定量PCR检测 　　采用SYBR方法，应用Biorad公司的定量PCR仪 IQ5进行定量PCR反应。反应体系：2×PCR缓冲液10 μL、5 μmol/L miRNA特异性PCR引物0.4 μL、 RT产物1 μL、5 U/μL Taq酶 0.2 μL、无酶水加至20 μL。反应条件： 95℃3 min，95℃ 12 s、62℃ 35 s，共40个循环。miR-200c的相对表达量通过公式2-△Ct计算，其中，△Ct=miR-200c平均Ct值-U6平均Ct值[5]。 　　1.4 统计学分析 　　采用统计软件SPSS 13.0进行统计学分析，两组间比较采用t检验。miR-200c表达水平与肝细胞癌临床病理参数进行Logistic回归分析，P0.05）。 　　2.3肝癌发病风险的多元Logistic回归模型 　　把单因素分析有统计学差异的影响因素纳入多元Logistic回归模型进行分析发现，肿瘤大小（OR=2.44，95%CI： 1.22～10.36）、血清AFP 高（OR=2.39，95%CI：1.78～5.34）、肿瘤分化程