miR—218抑制卵巢癌细胞A2780对顺铂耐药性实验研究.docVIP

miR—218抑制卵巢癌细胞A2780对顺铂耐药性实验研究 　　[摘要] 目的 研究miR-218抑制卵巢癌细胞A2780对顺铂耐药性的影响及可能机制。 方法 实时定量PCR检测A2780及顺铂耐药细胞株A2780/DDP中miR-218的表达，转染miR-218 inhibitors和mimics改变A2780及A2780/DDP细胞中miR-218的表达，MTT法检测转染前后细胞对顺铂的敏感性，并分析Wnt2B蛋白表达的改变。 结果 与A2780细胞相比，miR-218在A2780/DDP中的表达明显降低。A2780细胞转染miR-218 inhibitors后，细胞对顺铂的敏感性降低，Wnt2B蛋白表达明显增强；而A2780/DDP细胞转染miR-218 mimics后，细胞对顺铂的敏感性增强，Wnt2B蛋白表达明显减少。 结论 miR-218可能通过靶向Wnt2B抑制卵巢癌细胞A2780对顺铂的耐药性。 　　[关键词] miR-218；卵巢癌；顺铂耐药性；Wnt2B 　　[中图分类号] R737.31 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）08（a）-0007-04 　　卵巢癌死亡率位于女性生殖系统肿瘤之首，在女性肿瘤死亡率中位于第五位，多数死亡原因是肿瘤化疗耐药[1-2]。肿瘤耐药是个复杂的问题，涉及药物在体内及细胞内的转运、代谢、细胞的损伤与修复等多个方面[3]。 　　microRNA是一种非编码的小核糖核酸，其在自然界广泛存在，包括人体。研究表明其参与肿瘤细胞的化疗耐药[4-5]。有报道显示，miR-218在卵巢癌、乳腺癌和恶性黑色素瘤中均下调[6]，而在急性淋巴细胞白血病中为高表达[7]，这表明miR-218表达有细胞种属性，在不同的肿瘤细胞中功能和作用可能不同。还有报道显示，miR-218参与宫颈癌对顺铂的化疗耐药[8-9]。在卵巢癌中，具体情况如何，目前未见报道。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　卵巢癌细胞A2780及其衍生的顺铂耐药细胞株A2780/DDP，均获赠于华中科技大学同济医院肿瘤生物研究中心。RPMI 1640培养基、小牛血清、脂质体2000（美国Life Technologies公司）。顺铂、噻唑蓝（MTT）（美国Sigma公司）。miR-218 mimics和inhibitors及阴性对照（美国Dharmacon公司）。Wnt2B抗体（美国Abcam公司）。β-actin（美国Santa Cruz公司）。Trizol（美国Invitrogen公司）。miR-218逆转录引物及实时定量PCR扩增引物、反转录试剂盒、TaqMan MicroRNA试剂盒、U6 snRNA（中国锐博公司）。 　　1.2 A2780及A2780/DDP细胞中miR-218表达的Real-time PCR检测 ???　A2780及A2780/DDP细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，于37℃、5%CO2、饱和湿度的恒温密闭培养箱内传代、培养，细胞处于生长对数期时进行实验。按照Trizol说明书抽提总RNA，应用反转录试剂盒，按产品说明书将总RNA反转录成cDNA，应用TaqMan MicroRNA试剂盒对合成的cDNA进行实时定量PCR反应，反应条件：95℃变性1 min；95℃ 15 s，60℃ 20 s，70℃ 15 s，40个循环，U6作为内参照，分别进行数据分析。每一实验重复3次。 　　1.3 miR-218 mimics与inhibitors的转染 　　将处于生长对数期的A2780及A2780/DDP细胞接种于6孔板中，每孔加入1×106个细胞，培养24 h。按照脂质体2000说明书进行阴性对照（NC组）、miR-218 inhibitor和mimics组的转染，并设置空白对照。将miR-218 inhibitors及对照转染于A2780细胞中，miR-218 mimics及对照转染于A2780/DDP细胞中。转染6 h后换新培养基，继续培养24 h用于后续实验。Real-time PCR检测转染效率。 　　1.4 MTT法检测转染前后的细胞对顺铂的敏感性 　　将转染前后的A2780及A2780/DDP细胞，以每孔5×103个细胞接种于96孔培养板中。24 h后加入浓度分别为0、10、20、30、40、50 μmol/L的顺铂，每个浓度设3个复孔，培养48 h后加入MTT溶液（5 mg/ml）15 μl，继续培养4 h，弃上清，加入100 μl DMSO后振荡20 min，在酶联免疫检测仪上选择波长570 nm测定各孔光密度值（D），取重复孔光密度值的平均值。各浓度梯度孔的细胞存活率（%）=（D实验孔/D对照孔）×100%，