真核细胞RNA提方法及原理---Trizol试剂盒抽提法8.pptVIP

真核细胞RNA提取方法及原理 ---Trizol试剂盒抽提法 邱逸敏 12级生物技术 一、研究背景 二、方法及原理 1、研究背景 1.1 RNA研究的重要性 DNA，RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子，是生命现象的分子基础。 DNA的遗传信息决定生命的主要性状，而mRNA在信息传递中起很重要的作用。其它两大类RNA，rRNA和tRNA，同样在蛋白质的生物合成中发挥不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遗传信息由DNA传递到表现生命性状的蛋白质的过程中举足轻重。 2、方法及原理 2.1 RNA的提取流程 1、样本前处理 2、细胞裂解 3、 RNA的纯化及获得 RNA提取流程－－ 样品前处理注意点 RNA提取流程－－细胞裂解，以释放RNA 异硫氰酸胍/酚－TRNzol总RNA提取试剂 RNA提取流程－－ RNA的纯化及获得 2.2 RNA提取的注意事项 2.2.1 杜绝外源酶的污染 一：严格戴好口罩，手套。 二：实验所涉及的离心管，Tip 头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。 三：实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free。 2.2.2 阻止内源酶的活性 一：选择合适的匀浆方法。 二：选择合适的裂解液。 三：控制好样品的起始量。 2.2.3 明确自己的抽提目的 一：任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。 二：RNA 抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率。  2.3 Rnase 污染的10大来源 1：手指头 2：枪头 3：水/缓冲液 4：实验台面 5：内源 Rnase 6：RNA 样品7：质粒抽提 8：RNA 保存 9：阳离子 (Ca, Mg) 10：后续实验所用的酶 2.4 几种RNA提取方法 2.4.1 TRIzol法 TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。 TRIzol法提取流程 1 ．取新鲜叶片，液氮研磨，每100mg加入 1ml Trizol 充分匀浆，室温静置５-10 min 。 2 ．加入 0.2ml 氯仿，振荡 15s ，静置 3min 。 3 ． 4 ℃ 离心， 12000rpm × 12min ，取上清。 4 ．加入 0.5ml 异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置 15-20min 。 5 ． 4 ℃ 离心， 12000rpm × 10min ，弃上清。 6 ．加入 1ml 75% 乙醇，轻轻洗涤沉淀。 4 ℃ ， 12000 rpm× 3min ，弃上清。 7.? 室温晾干，加入30-50ul的 DEPC H 2 O 溶解， 检测。 * * 选择新鲜血液，不得超过4小时 选择新鲜的幼嫩组织 选择处于生长旺盛的时期收集细胞 选择新鲜组织，生长旺盛的组织 可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到的白细胞 然后加入一定量的TRNzol，-70℃保存较长时间 去掉培养基，加入一定量TRNzol -70 ℃保存较长时间 使用专门的RNA样品 储存液进行储存 液氮或加入RNase抑制剂中保存， 避免反复冻融 RNA提取流程－－ 样品前处理中如何保存样本 独特配方--RNAplant植物RNA提取试剂 胍盐/β-巯基乙醇—RNAprep系列RNA提取试剂盒 RNA纯化要求 1 纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用物质 2 排除有机溶剂和金属离子的污染 3 蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度 4 排除DNA分子的污染 细胞 基因组DNA 水相 有机相 RNA 氯仿 纯化 pH5.7 离心 加入裂解液 (Trizol-A+) 实验流程图 细胞选择 贴壁细胞 悬浮细胞 选择新鲜的 幼嫩组织 纯度（ OD260/OD280 ） 紫外分光光度计进行测量（选择正确的稀释倍数，确保OD260 值在0.1~1.0之间）OD260/OD280 1.7 说明有蛋白的污染OD260/OD280 2.0 说明纯度很好 230nm存在高吸收表明有碳水化合物的干扰。 OD260/OD280 = 2.5