生化试验(最最终完整版).ppt

原理 血清中的胆固醇先经胆固醇酯酶(CHE)水解为脂酸和游离胆固醇。后者与血清中原有的游离胆固醇一起在胆固醇氧化酶(CHO)氧化下生成孕烯酮并生产过氧化氢(H2O2)。过氧化氢在辣根过氧化物酶(HRP)催化下与4-氨基安替比林和苯酚缩合成红色的醌亚胺安替比林，因而可以通过Trinder反应偶联比色终点法测定胆固醇的质量。上述三个酶的催化作用呈连锁反应。实验中把三个酶配成单一试剂。便于使用。 化学方程式 血清中的胆固醇+H2O ------------ 胆固醇+脂肪酸 （条件：胆固醇酯酶(CHE)催化） 胆固醇 ＋O2 -----------孕烯酮＋H2O2（条件：胆固醇氧化酶(CHO)氧化） 2H2O2 + 4-氨基安替比林 + 苯酚 ------ 醌亚胺(显红色) + 4H2O (条件：辣根过氧化物（HRP）催化） 试剂 1.基础液：胆酸钠129mg，苯酚0.1ml=132mg,TritonX-100（聚乙二醇辛基苯基醚 ）0.2ml,以上各试剂溶于0.1mol/l磷酸缓冲液（PH6.7）100ml中。 2.酶试剂应用液：临用前取商品三酶合剂1ml加基础液30ml混合即可。 3.胆固醇标准液储备液（4mg/ml)：精确称量胆固醇0.4g溶于分析纯无水乙醇中，移置100ml容器中，稀释至刻度。 4.胆固醇标准应用液（2mg/ml）：临用前用分析纯无水乙醇稀释。 注意事项 1 ．试剂中酶的品质影响测定结果。 2 ．溶质称量以及溶液配制等操作要规范。 3 ．胆固醇标准储备液和胆固醇标准应用液要用无水乙醇。 应用 取试管3支，标号，按下表操作： 混匀。同时置于37°C水浴中保持15分钟，取出，于721型分光光度计，用空白管调零，500nm波长，比色。 反应后各试管均加1ml蒸馏水 计算 血清总胆固醇（mg%）=At/As×5.2 参考值：2.5~5.7mmol/l(110~230mg/dl) 换算系数：0.02506 酶法测血清中胆固醇方法的优缺点 优点：酶法具有特异性好,精密度和灵敏度都能很好的满足临床实验室的要求,既可手工操作,也可自动分析.既可作终点法检测，也可作速率法检测。本法操作简单，血清、试剂用量少，检测快速，准确性及重复性好， 缺点：血清总胆固醇酶法测定因基础试剂配制后数小时变成紫红色,不易保存,易造成误差和浪费 临床意义 1.胆固醇升高： 　　胆固醇是动脉粥样硬化的重要危险因素之一。 　　胆固醇升高容易引起动脉粥样硬化性心、脑血管疾病如冠心病、心肌梗死，脑卒中等。 　　胆固醇为一个诊断指标来说，它既不够特异，也不够敏感，所以不能作为诊断指标，只能作为评价动脉粥样硬化的危险因素，而最常用做动脉粥样硬化的预防、发病估计、治疗观察等的参考指标。 　　胆固醇升高可见于各种高脂蛋白血症、梗阻性黄疸、肾病综合征、甲状腺功能低下、慢性肾功能衰竭、糖尿病等时。 　　此外，吸烟、饮酒、紧张、血液浓缩等也都可使血液胆固醇升高。 　　妊娠末三个月时，可能明显升高，产后恢复原有水平。 　　2.胆固醇降低： 　　可见于各种脂蛋白缺陷状态、肝硬化、恶性肿瘤、营养吸收不良、巨细胞性贫,恶性贫血、溶血性贫血、甲状腺机能亢进、急性感染，等 　　女性月经期也可降低。 另一种方法测血清中的胆固醇 血清总胆固醇的测定——邻苯二甲醛法 实验原理 血清胆固醇(chol)测定是动脉粥样硬化性疾病防治、临床诊断和营养研究的重要指标。正常人血清胆固醇含量范围100 ~ 250mg/mL。胆固醇是环戊烷多氢菲的衍生物，它不仅参与血浆蛋白的组成，而且也是细胞的必要结构成分，还可以转化成胆汁酸盐、肾上腺皮质激素和维生素D等。胆固醇在体内以游离胆固醇及胆固醇酯两种形式存在，统称总胆固醇。总胆固醇的测定有化学比色法和酶学方法两类。本实验采用前一方法。胆固醇及其酯在硫酸作用下与邻苯二甲醛产生紫红色物质，此物质在550nm波长处有最大吸收。因此，可用比色法作总胆固醇的定量测定。胆固醇含量在400mg/100mL以内时，与光吸收值呈良好线性关系。本法不必离心，颜色产物也比较稳定。 临床方法：超微量酶法 酶标生化多功能分析仪。用超微量血清在微孔板内进行酶法检测总胆固醇（TC），分析其线性范围、准确度、精密度、回收率，探讨超微量酶法检测总胆固醇结果的可靠性。方法 采用超微量酶法，酶标生化多功能分析仪比色测定。结果 本法的线性范围达15.1mmol/L，批内变异系数（CV）为1.29%～2.45%，日间变异系数（CV）为1.95%～2.67%，回收率为99%～105%，平均102.8%，与全自动生化分析仪比较具有良好的相关性，y=1.112x-0.339，r=0.9839。结论 ：本法操作简单，血清、试剂用量少，检