生物显微技术2.ppt

目的 （以石蜡切片为例 ） 目的：除去组织中的透明剂（如二甲苯）而代之以石蜡，使石蜡渗入组织内部后支持组织，把软组织变为适当硬度的蜡块以便“保持原状”切成薄片，再经染色或组织化学反应时，不致失真。 方法 透蜡方法：将组织块经过二甲苯透明后，移入二甲苯与石蜡的等量混合液（即1/2二甲苯）中或用冷风稍干并立即投入到液体石蜡中去。透蜡时组织需经过数次纯石蜡（石蜡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），使石蜡中含有的剩余透明剂完全去尽，以免影响透蜡程度。通常动物的组织材料只要经过两次纯石蜡即可。在组织更换蜡杯时要有一定的间隔时间，尽量减少组织内含有的二甲苯被带入最后的纯石蜡杯中去。 透蜡时间根据不同组织类型及其大、小而定，基本上与组织固定时间成正比。总之对不同种类的组织，其致密度和细胞成分不一样，所用的透蜡时间也不一样。 包埋剂的种类 常用的有石蜡、火棉胶、碳蜡、明胶等。 1．石蜡（Parraffin） 动植物切片技术中应用最广，根据熔点不同有软蜡（低熔点）和硬蜡（高熔点）之分。软的材料用软蜡，硬的材料用硬蜡。一般普遍应用熔点为56℃以上的石蜡。低熔点在54℃以下的用于酶的显示和保存抗原活性。56~58℃是比较适中的温度。经过透蜡的组织被包埋起来，有利组织切片的连续性，展片平整，结构成分保存较好，特别是整个蜡块的资料保存可靠。 选硬度与组织硬度相近的石蜡。 切片较薄时（≤8μm）需用较软的石蜡。 室温高时用硬蜡，室温低时用软蜡。 旧蜡比新蜡为好。 2．火棉胶（Celloidin） 三硝基纤维素，易燃不易爆，易溶于纯酒精及乙醚的等量混合液中成为液体，可溶于丙酮及丁香油等。不溶于氯仿及其混合液，遇水凝固呈乳白色。火棉胶溶剂有强挥发性，必须紧封瓶口，如瓶盖松弛溶剂挥发，用以包埋后韧性减低，切片易破裂。火棉胶液宜用双盖瓶于冷暗处贮藏保存。 火棉胶配制时，以2g、4g.…..12g等不同分量取其固体分别装入洁净干燥的容器中，然后取无水乙醇50ml加入各瓶中，密闭瓶盖放置一晚，火棉胶吸取无水乙醇后即膨胀呈肉冻状，此时再在每瓶中各加无水乙醚50ml，密封瓶口放置一晚，即可彻底溶化即成2%、4%……12%等的火棉胶液。目前使用火棉胶透入组织较少，用于染色前的覆盖液较多，将原装5%火棉胶液再稀释成5%~7%浓度，作为组织切片覆盖液。 3．碳蜡（Carbowax） 为水溶性的油蜡，是多乙烯二醇，是具有长分子结构的高分子碳水化合物。使用时以分子量为准，分子量100为液态，600为软膏状，1000以上有各种不同的硬度。包埋用的碳蜡有分子量为1500和4000两种，碳蜡1500熔点为35~40℃，室温时呈硬凡士林状，碳蜡4000熔点为50~55℃，室温呈固体石蜡状。 优点：组织固定水洗后无需经酒精及二甲苯即可直接用炭蜡包埋，因而组织收缩小，对脂肪及类脂质无破坏作用。包埋快，可制成较薄切片和连续切片。 缺点：对大块及坚硬易碎的组织不适宜，连续切片不及石蜡质量高，碳蜡在较高温度时能软化，吸水性强，易溶化，故组织块应放在干燥器内以免吸水溶化。 4．明胶 明胶有片型及粉型，均以浅黄色的质量较好。 包埋方法 根据所用包埋剂的性质分为三种： 1．熔化法 将组织包埋在一种物质内。使组织内充满该物质；然后被包埋进去，此种物质必须具有冷后为固体、热时为液体的性质，如石蜡或明胶，在常温下为固体加热后即熔解为液化。 2．挥发法 利用某些物质能在一种溶剂内溶解成为液体状态，使组织浸入该溶液内充满该溶液，再使溶剂蒸发成为固体如火棉胶，它可溶于挥发性溶剂无水酒精和乙醚的混合液中成为液体，组织浸入一定时间后使溶剂挥发成为固体。 3．双重法 兼用以上二种方法，将材料先用火棉胶渗入，再入石蜡中包埋。使用此方法的目的是可减少组织的收缩及扭转，并可运用石蜡切片法作连续切片。而单用火棉胶法不能作连续切片。 （一）石蜡的透入与包埋法 当组织块在透明剂中透明以后即开始让石蜡渗入组织的内部。所谓石蜡的透入作用，就是先将石蜡熔化在组织透明剂内，如石蜡与二甲苯的等量混合液（或苯与石蜡，氯仿与石蜡等）中，这样可减少组织的收缩和扭转，使蜡随着透明剂渗入到组织的每个部分，然后再逐渐增高石蜡的溶解量，并逐渐减少透明剂的量，最后到纯石蜡中则透明剂完全被石蜡所取代。 透蜡的要点 ①石蜡要完全渗入细胞的每个部分，即使空泡内也要完全渗入。 ②石蜡要紧密而均匀的贴在细胞内外两面，使组织与石蜡成为不可分离的状态。 透蜡的温度 控制温度是透蜡极其重要的关键。透蜡时石蜡的温度应与石蜡的熔点相配合，温度不可过高或过低，温度过高会使组织高度收缩变脆，无法切片，温度如低于熔点，石蜡凝固将达不到透蜡的效果。可适当调节至高于石蜡熔点2~3℃。 透蜡时间 根据不同组织类型及其大小而定，基本上与组织固定时间成正比。对细胞体小，密