分子生物学5 分子生物学基本的研究法.ppt

5. 2. 5 基因组DNA文库构建 把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆。汇集包含基因组中所有DNA序列的克隆（理论上每个序列至少有一个代表），这样的克隆片段的总汇，称为基因组DNA文库。 构建基因组文库最常用的是λ噬菌体载体（克隆能力约15—20kb）和限制性内切酶部分消化法。例如用识别4个核苷酸的核酸限制性内切酶Sau3A，与BamHI是一对同尾酶消化DNA，由Sau3A酶切产生的DNA片段可插入到经BamHI消化的λ噬菌体载体上。 图5-13 用Sau3A限制性核酸内切酶消化真核生物基因组DNA并利用?噬菌体载体构建基因组文库的过程图示。 λ噬菌体作为克隆载体 此外，还有很多大容量克隆载体，如柯斯质粒、细菌人工染色体（BAC）、P1源人工染色体（PAC）、酵母人工染色体（YAC）等都可用于基因组文库的构建。 它们的优点是可以插入更大片段DNA，但是稳定性一般较差，在大量复制的过程中容易出现缺失现象。操作也相对较困难。 5. 3 RNA基本操作技术 真核生物基因组DNA庞大，有大量重复序列，很难直接分离得到靶基因片段。而cDNA来自反转录的mRNA，无冗余序列，通过筛选cDNA文库，可较快地分离到相关基因。 他有一条知名的可能引起不少同学共鸣的学习曲线：刚开始时，对拓宽自身知识面表现出极大的兴趣—知识迅速上升，然后徘徊不前，最终进入失望和不安阶段—辞职 以后去一家小咖啡馆当了两年经理。1979年加入西特斯公司，负责DNA合成。 正是费时费力的DNA合成（单引物，以算术级数增长），激发了他的思维。 1983年8月，穆利斯第一次在公司正式作了一个有关PCR原理的学术报告。人们对这个报告的反应冷谈，只有少数几个实验技术人员有些兴趣。穆利斯回忆说，“绝大多数人要么在我结束报告之前就离开了会场，要么故意留下来给我出难题。他们认为这些肯定是胡说八道。” 普遍的观点是，虽然我不够聪明，没看出问题的要害所在，但肯定有理由证明这个方法不行，要不为什么从前没人想到呢？ PCR技术的原理 首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸和实验中提供的引物序列合成新生的DNA互补链。 DNA解链（变性） 引物与模板DNA相结合（退火） DNA合成（链的延伸）三步。 经不断重复循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应是2n,实得1.8n. 将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温（94℃）环境下加热1分钟，使双链DNA变性，形成单链模板DNA。 94℃加热，淬火 降低反应温度（退火，约50℃），约1分钟，使寡核苷酸引物与两条单链模板DNA结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上。 50℃~60℃，退火 引物与模板DNA相结合 将反应混合物的温度上升到72℃左右保温1-数分钟，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板分子按5→3方向延伸，合成新生DNA互补链。 PCR扩增，72℃左右, 按每 分钟1000个碱基对设计 循环往复 应用实例： 实验中通过对拟南芥基因芯片数据分析, 鉴定出一个受干旱胁迫诱导的cDNA。干旱、紫外线、脱落酸、高盐以及水杨酸等胁迫条件处理后表达量均有显著提高, 特别是干旱处理3h后表达量极显著提高。 多序列比对和系统进化分析发现该基因含有典型的AP2/EREBP DNA结合结构域，且属于DREB亚家族。由于其N端富含谷氨酰氨残基, 将它命名为QRAP2 (Glutamine-rich AP2)。 常规PCR技术能扩增两引物之间的DNA区段，然而，有时我们也希望扩增位于靶DNA区段之外的未知DNA序列，这就需要应用反向PCR（reverse PCR）技术。 用一种在靶序列上没有酶切位点的核酸限制性内切酶消化DNA； 产生大小不同的线性DNA片段群体，其中靶DNA区段的DNA分子长度不超过2~3kb，经连接后重新环化； 按靶序列设计的一对引物与互补序列退火结合，其延伸方向如箭头所指； 反向PCR的基本操作程序。波纹线表示靶DNA区段，箭头表示限制性内切酶位点，分别用方框表示靶DNA区段的左侧和右侧序列。 RACE技术（rapid amplification of cDNA ends）(Page 183) 在已知cDNA序列基础上克隆5’或3’端缺失序列的技术。根据已知序列设计基因片段内部特异引物，由该片段向外侧进行PCR扩增得到目的序列。用于扩增5’端的方法称为5’RACE，用于扩增3’端的称为3’RACE。 5’ RACE 在反转录酶的作用下，以基因片段内部特异性引物（GSP