TLCS法2010.4.12.ppt

五、薄层色谱定量法 （Thin Layer Chromatograph Scanning TLCS ）  定义 用一定波长的单色光照射到层析的斑点上，利用斑点对光的透射和反射来测定斑点中组分含量的方法 。 2005版药典有45个 中药及制剂草用此法。 黄连薄层色谱图 优点： 1、测定准确度高：±2-5%。 HPLC ± 1-3%。 2、检测灵敏度高： Vis-uv检测10-6-10-7g /斑点 ； 荧光检测10-9g/斑点 。 3、测定速度快：十几分钟到几时分 钟完成。 4、分辨率高：斑点距离在20um可分辨（此距离肉眼看不见） 缺点 ： 1、不能形成流水化操作：点样、 层析与扫描不能连续操作。 2、“开式”层析重现性差。 3、吸附剂的种类受到限制：如键 合相硅胶还不能使用。 （因其散射参数SX 未知） （一）基本原理 1、Kubelka-Munk理论方程的建立 在光度法中，物质对光的吸收关系符合Lambert-Beer定律，要求在均质透明的溶液中进行测定，光照射其中，只有吸收和透射。 在薄层板上测定，吸附剂为非透明的，而且颗粒也不完全均匀一致，光照射到吸附剂上，除吸收外，还有反射，由于表面不平，固体吸附剂会产生散射，剩余部分才会透射出来。因此在薄层板上的规律不符和Lambert-Beer定律，而是符合Kubelka-Munk理论方程。 Kubelka-Munk方程表达了单色光照射到薄层板上，光的反射和透射与吸附剂的散射和吸收的关系。 用线性化器的几点说明： （二）TLCS法的条件选择 1、测光方式选择：（photo mode select） 2、波长选择（Wavelength select） 3、扫描方式选择：（Scan　Mode Select） 测光方式选择： （1）吸收测定（Absorption ，ABS） a：反射吸收测定（ABS Reflection） b：透射吸收测定（ABS Transmission） （2）荧光测定（Fluoresence） 反射吸收测定 A. ABS Reflection 光源用钨灯或氘灯 此法的特点： 对薄层厚度要求不高，受薄层表面的均匀程度影响较大；灵敏度不高，重现性较好。------定量常用方法 ? 透射吸收测定 b：ABS Transmission: 此法的特点：扫描波长大于300nm时，用玻璃载板；小于300nm时用石英玻璃板；薄层的厚度及表面的均匀程度对它都有影响；此法的灵敏度较高，一般用于微量斑点和近似透明物质的测定。 （2）荧光测定（Fluoresence） 用一定波长的激发光照射斑点，斑点上的物质产生荧光，产生荧光的强度与斑点中物质的含量呈正比关系。 2.波长选择（Wavelength select） （1）单波长测定（Single Wavelength ) --- ----------------用于定性 误差大，不能消除薄层不均匀带来的误差（不同地方将会形成不同的散射） （2）?双波长测定（Daul wavelength） -------------------------用于定量 双波长选择的原则： 样品波长（λs）：待测组分的吸收光谱的最大吸收波长。 参比波长（λR）：待测组分不吸收或吸收很小的波长。 3、扫描方式选择（Scan　Mode elect） （1）线性扫描（Linear Scan） 特点：适于规则斑点的测定； 测定速度快，适于定性。 特点：适于形状不规则和浓度分布不均匀斑点的测定； 准确度好，稳定性好，适于定量。 三、TLCS法在鉴别中的应用 人参TLCS图 西洋参TLCS图 三七TLCS图 （三）定量方法： 1、外标法： 样品与对照品在同一薄层板上的不同位置进行展开。 首先绘制标准曲线。 1 、看标准曲线是否通过原点，确定用外标一点法还是两点法； 2、找出点样量的线性范围。 外标法 外标一点法： C标=FA标 求出F C样=FA样 外标法 外标两点法： C1=F1A1+F2 C2=F1A2+F2