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一株纤维素酶产生菌的鉴定及酶学性质研究 1 引 言 1.1 研究纤维素酶的作用和意义 纤维素是植物纤维的主要成分，也是地球上最丰富的可再生有机资源。据报道，全世界每年通过光合作用产生的纤维素，其中有89%尚未被人类利用，我国每年仅农业生产中形成的农作物残渣(稻草、秸秆等)就约有7亿t，如何有效利用这些资源已经成为近年来研究的热点。纤维素占植物干重的35%-50%，是地球上分布最广的碳水化合物，同时又是自然界数量最大的可再生资源。纤维素废弃物的有效利用和生物转化已成为世界上许多国家关注的重要科研领域之一。要使纤维素酶真正能够用于工业生产，首先要降低纤维素酶的生产成本。因此，选育高酶活的纤维素分解菌株就成了解决问题的关键之一。 1.2 牛胃消化纤维素 图1-1 图1-2 瘤胃微生物(rumen rnicrobes)是指栖息在瘤胃中的微生物瘤胃微生物能分泌纤维素酶，因此瘤胃有较强的发酵和分解纤维素的作用。在瘤胃微生物中，对纤维素降解起主要作用的还是瘤胃细菌本文主要从牛中分离出氧的高产纤维素酶细菌，对分离所得菌株进行初步鉴定及并对其发酵产纤维素酶的酶学性质进行初步探讨，最终得到产纤维素酶，蛋白胨10.0g 牛肉膏10.0g 酵母膏5.0g 柠檬酸氢二铵[（NH4）2HC6H5O7] 2.0g葡萄糖(C6H12O6·H2O) 20.0g乙酸钠（CH3COONa·3H2O5.0g ，磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）2.0g硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.58g 硫酸锰（MnSO4·H2O）0.25g琼脂 18.0g蒸馏水1000mLpH6.2～6.6。 Q菌的硝酸盐培养基：硝酸盐培养基，硝酸盐培养基成分硝酸钾0.2g蛋白5蒸馏水1000mLpH 7.4。试剂：甲液（对氨基苯磺酸0.8g 5moL/L醋酸lOOml；乙液（α-奈胺0.5g+5moL/L醋酸lOOmL）。 Q菌的酚红肉汤基础培养基：肉汤培养基的碳源为甘油，称之为甘油肉汤培养基胨 20g甘油 10m氯化镁(无水) 1.4g琼脂14g硫酸钾(无水) 10g 水 1000m取胨氯化镁和硫酸钾加入水中微温溶解调节pH使灭菌后为7.3±0.1，加入甘油和琼脂加热溶化混匀分装于试管，灭菌，制成斜面。(DNS)，1%CMC-NA溶液，蛋白胨，牛肉膏，尿素，硫酸铵，硝酸钠，0.05 mol/L柠檬酸缓冲液等。 仪器：显微镜，染色片，酒精灯，接种针，DHP-9272型电热恒温培养箱；UV-2000分光光度计；pHS-25型pH 计；电热恒温水浴锅；高速离心机；恒温摇床等。 2.2 形态学观察 2.2.1实验的内容 用显微镜观察Q菌染色装片。 2.2.2 实验材料和用具 Q菌的染色装片，香柏油，二甲苯，显微镜，擦镜纸。 2.2.3 操作步骤 将显微镜的置于平稳的实验台上，调节好光源；上升镜筒，将Q菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至物镜正下方，物镜降至距装片0.5cm处，适当缩小光圈，然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使物镜逐渐上升至发现物象时，改用细调节器调节到物象清楚为止。移动装片，把合适的观察部分移至视野中心；眼睛离开目镜从侧面观察，旋转转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与破片相撞。再用目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜。用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。将最适宜观察部分移至视野中心。不要移动装片位置，准备用油镜观察；提起镜筒约2cm，将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位滴香柏油。从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头。 将光线调亮，左眼从目镜观察，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中有物象出现时，再用细调节器校正焦距。如因镜头下降至未到位或镜头上升太快未找到物象，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作直至物像看清为止。 2.2.4 实验观察的结果 Q菌落：呈直径3-7mm圆形，中央略凹陷；菌落呈白色，有光泽，菌落突起，边缘平整；部分有芽孢，芽孢呈椭圆。 2.3 生理生化鉴定 2.3.1 Q菌的革兰氏染色 革兰氏染色法初染、脱色复染等四个步骤，具体操作方法是： 涂片固定草酸铵结晶紫染1分钟自来水冲洗加碘液覆盖涂面染3分钟水洗，用吸水纸吸去水分加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色20秒后水洗吸去水分。蕃红梁色液（稀）染10秒钟后，自来水冲洗干燥，镜检。 染色的结果菌体呈紫色。(1)菌种：Q菌的硫化氢培养基,内含蛋白质与硫代硫酸钠作为硫受质，另含硫酸铵亚铁作为硫化氢指示剂(2)器材：酒精灯，接种针 (3)实验步骤 无菌操作将Q菌分别穿刺接种至培养基中。将所有试管置