发酵工程实验讲义2010129.doc

----10升发酵罐的分批发酵 ［实验目的］ 通过本实验加深对发酵罐结构原理和分批发酵原理的认识，了解工业发酵的基本工艺和方法并掌据相关发酵参数的测定方法。 ［实验原理］ 一、分批发酵原理 分批发酵是一种准封闭式系统，种子接种到培养基后除了气体流通外发酵液始终留在生物反应器内，在此简单系统内所有液体的流量等于零。它的一个显著特点是培养基一次性加入，产品一次性收获，是目前广泛采用的一种发酵方式。其优点是： 对温度的要求低，工艺操作简单； 比较容易解决杂菌污染和菌种退化等问题； 对营养物的利用效率较高，产物浓度也比连续发酵要高。缺点是： 人力、物力、动力消耗较大； 生产周期较长，由于分批发酵时菌体有一定的生长规律，都要经历延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期，而且每批发酵都要经菌种扩大发酵、设备冲洗、灭菌等阶段； 生产效率低，生产上常以体积生产率（以每小时每升发酵物中代谢产物的 g 数来表示）来计算效率，在分批发酵过程中，必须计算全过程的生产率，即时间不仅包括发酵时间，而且也包括放料、洗罐、加料、灭菌等时间。KH2PO4 为0.38g/L，麦麸为5.20 g/L，玉米粉为6.49 g/L。 荧光假单胞菌： 糖蜜6.73g/L，麦麸13.09g/L，KH2PO4 0.53g/L,米糠10g/L, Nacl 2g/L, MgSO4 1/L。 大肠杆菌： 糖蜜=4.5g/L 玉米浆=8.5g/L 工业蛋白胨=8.5g/L K2HPO4=2.3g/L KH2PO4=1.5g/L 甘油=10ml/L MgSO4.7H2O=0.25g/L 相关试剂 （1）3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂的配制 将1.0g 3,5-二硝基水杨酸溶于13.33mL 2N NaOH溶液中（不适宜用高温促溶，可以50—60℃溶解），接着加入100mL含26g酒石酸钾钠的溶液，混匀。再加入1g结晶酚和1g亚硫酸钠，搅拌溶解后，定容至200mL。暗处保存备用（用棕色瓶装）。 （2）碘液:5g碘和10g碘化钾，溶于100mL水中。 （3）酚酞指示剂：称取0.1g酚酞，溶于250mL 70%（V/V）的乙醇中。 （4）HCl溶液（6N） 用配好的 取500mL12NHCl，用水稀释至1000mL。 （5）NaOH溶液（6N） 用配好的 取240gNaOH，加水溶解，定容至1000mL。 （6）无氨水：可用一般纯水通过强酸性阳离子交换树脂或加硫酸和高锰酸钾后，重蒸馏得到。 （7） 25%的NaOH溶液。 （8）10%硫酸锌溶液。 （9） 纳氏试剂：称取16g氢氧化钠，溶于50mL水中，充分冷却至室温。 另称取7g碘化钾和碘化汞(HgI2)溶于水，然后将此溶液在搅拌下徐徐注入氢氧化钠溶液中。用水稀释至100mL，贮于聚乙烯瓶中，密塞保存。 （10）酒石酸钾钠溶液：称取50g酒石酸钾钠(KNaC4H4O6·4H2O)溶于100mL水中，加热煮沸以除去氨，放冷，定容至100mL。 仪器设备 双联自动机械搅拌不锈钢发酵罐、空气压缩机、蒸汽发生器、PLC控制柜、电脑、紫外分光光度计、恒温生化培养箱、恒温振荡培养箱、数显恒温水浴箱、超净工作台、电磁炉等。 ［实验步骤］ 一、菌种的制备 取冷冻甘油种接种到LB琼脂板中，在琼脂板中挑取单菌落接到试管斜面。取斜面种接种于装有50ml/瓶液体LB培养基的500ml三角瓶中，220rpm,30oC摇床振荡培养过夜（约16h）。根据接种量5%确定种子液为200ml,发酵前准备种子液50ml/瓶共6瓶，2瓶备用。 二、发酵液的制备(先有机再无机，最后定容) 先取鱼粉40g，麦麸20.8g, 玉米粉25.96g 加热至沸腾并保持微沸30min,然后加入糖蜜40g 过滤培养基然后加入Nacl 10g， CaCl2 4g，MgSO4·7H2O 5g，KH2PO4 为1.52g。定容至3400ml(10L发酵灌采用发酵液4L,实消时会产生大约15%的冷凝水)。 三、工艺流程 启动发酵罐 打开空气压缩机电源，按start键；检查蒸汽发生器水箱水位，打开电源开关；检查发酵罐水箱水位。 发酵罐空消及空气管道消毒 待压缩空气压力和蒸汽压力不再上升时，进行过滤器及管道消毒、空消。 ⑴关V134、V135、开V137、V125，排出夹套中的冷凝水并对夹套进行升温，关V125，关V137。 ⑵开V126、V152，排尽蒸汽管中冷凝水后将V152转为微开；开V151，微开V106，调节使罐内升压至0.11MPa。 ⑶关V101，开V121，开V104，排尽冷凝水，将V104调为微开，开V103，关V151，维持罐压0.11～0.12MPa之间 30min。注意V101一定要关死，防止蒸汽进入流量计使其损坏。 ⑷关V12