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TUNEL细胞凋亡试剂盒内容及操作步骤 　　凋亡细胞的原位末断转移酶标记法(TUNEL法) 　　细胞凋亡的多步骤机制作用的最终环节是;细胞内源性核酸内切酶的激活而导致核染色质DNA双链的断裂。大量DNA片段暴露出的3羟基在末断转移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT)或DNA多聚酶的作用下，与生物素或地高辛标记的核苷酸结合，最终借助与卵白素或抗地高辛抗体结合的荧光素或HRP，使凋亡细胞被特异性地标记和显示出来。 　　TUNEL细胞凋亡试剂盒由美国罗氏公司提供 　　试剂1：酶浓缩溶液(EnzymeSolution) 　　试剂2：标记溶液(LableSolution) 　　试剂3：转化剂-POD(Converter-POD) 　　酶标记抗荧光素抗体(即用型) 　　试验所需其它试剂： 　　非石蜡切片: 　　·冲洗缓冲液:磷酸盐缓冲液(PBS) 　　·阻断溶液:%H2O2甲醇溶液 　　·固定溶液:4%多聚甲醛(溶剂新鲜配制的PBS溶液) 　　·渗透液:%Triton甔-100(溶于新鲜配制的%枸橼酸钠溶液) 　　石蜡切片: 　　·二甲苯和乙醇(100%、95%、90%、80%、70%用蒸馏水稀释) 　　·冲洗缓冲液:磷酸盐缓冲液(PBS) 　　·蛋白酶K工作液10~20mg/ml溶于10mMTris/HCl(~) 　　根据需要选择: 　　·渗透液:%TritonX-100(溶于新鲜配制的%枸橼酸钠溶液) 　　·胃酶溶液(%-%溶于HCl，pH2)或胰酶 　　·枸橼酸缓冲液，pH6，微波修复 　　材料：微波炉，微波输出功率850W-2000W2.选用中性甲醇固定的活检及实验动物标本，常规脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。 　　 　　操作步骤 　　抗原微波修复(供参考) 　　1.组织经福尔马林固定后会产生广泛的蛋白质交连，因此石蜡组织进行凋亡检测时要进行预处理。经我公司科研人员的长期研究认为：TUNEL染色时蛋白酶K的作用有可能引起内源性核酸内切酶的释放，造成假阳性反应，同时过量的蛋白酶K处理可破坏组织的结构，用微波技术替代上述处理可避免上述弊端的出现。 　　2.微波已被愈来愈多地作为免疫组织化学和原位杂交的预处理过程，经一定温度的微波处理可修复因固定和包埋造成的抗原破坏，打断氨基酸的肽键结合，促进抗原决定簇的暴露，恢复细胞膜的空间结构，增加穿透效应，加速组织处理及染色过程。我们在作TUNEL染色前进行微波修复，可以达到蛋白酶K的功效，取得较为理想的效果，背景染色很浅，凋亡细胞阳性颗粒与背景染色对比非常鲜明。 　　3.蛋白酶K作用的条件严格，消化度常因组织的不同而在操作中不便掌握。同时蛋白酶K的价格昂贵，而微波已作为一种常用仪器用于免疫组织化学染色中。 　　(1)切片常规脱蜡入水 　　(2)将一烧杯盛200ml的、的柠檬酸缓冲液，加热至90～95，迅速放入切片，使用680W(80%功率)、微波照射1min，加入双蒸水(20～25)80ml作迅速冷却，将玻片移至PBS(20～25)。(3)PBS洗5min×3次。 　　(4)加20%正常牛血清室温30min。 　　(5)将TUNEL反应混合液加在切片上，37温育90min(阴性对照片、TUNEL混合液中不加TDT)。 　　(6)PBS洗5min×3次。 　　(7)3%H2O2甲醇液室温阻断10min。 　　(8)37温育90min。 　　(9)加POD转化剂，37温育30min。 　　(10)PBS洗5min×3次。 　　(11)DAB/H2O2显色。 　　(12)苏木素淡染，常规脱水，透明，中性树胶封固。 　　结果：细胞核呈棕色颗粒者为阳性细胞，结合形态特征，可确立凋亡细胞。阴性对照片无棕色颗粒。 　　细胞凋亡的检测技术简介(供参考) 　　一.凋亡细胞的形态学改变 　　细胞表面：伪足,微绒毛等消失 　　细胞体形态：细胞皱缩，变形，体积变小 　　细胞核：染色质浓缩，早期染色质聚集于核膜边呈新月形或环形，晚期碎裂 　　细胞器：密集但形态及结构完整，早期内质网短暂扩张细胞膜:完好，晚期包裹细胞器或核碎片，形成凋亡小体 　　在组织中表现：常常以单个细胞散在 　　发生周围组织反应：凋亡细胞或小体被邻近巨噬细胞，上皮细胞吞噬，降解，不发生炎症反应 　　发生条件：属于基因控制的程序性细胞死亡，多发生于器官萎缩，细胞介导的免疫杀伤机制，小剂量毒素作用以及多种病理生理状态 　　二.细胞凋亡的形态学检测方法 　　(一)凋亡细胞的光镜和荧光显微镜检测 　　1.制片 　　(1)常规组织学切片，进行脱蜡和水化。 　　(2)培养细胞可用细胞离心仪制片。由于凋亡细胞在制片中容易破碎,所以应采用低速离心制片(250g,离心5min)，并事先将载玻片用1%BSA处理，使细胞易于贴附.