分子诊断学_绪论感染性疾病的分子诊断ppt课件.ppt

巨细胞病毒(cytomegalovirus virus, CMV) Section 3 病原菌的基因检测 结合分歧杆菌的基因检测 结核分歧杆菌MTb，俗称结核杆菌TB，是结核病的致病菌。带病菌的痰液是TB主要的传染源。 MTbH37Rv基因组结构：环状双链DNA，共4 411 529kb，富含重复序列尤其是插入序列、多基因的家族序列及重复的管家基因序列。 TB分子诊断方法1 临床标本处理： 标本：痰、胸腹腔积液、血清、尿液、脑脊液 处理：液化剂去除粘蛋白，若带血则用红细胞裂解液去除血红蛋白，提取DNA TB分子诊断方法2 常用的是靶分子扩增方法：直接PCR法、SDA法、LCR法 扩增片段：抗原蛋白编码基因-165bp、MBP64-240bp、IS6 110-123bp、IS986-245bp、16S DNA-584bp TB的种属鉴定：以16S rRNA为靶基因 美国FDA：Amplicor检测和MTD检测 TB分子诊断方法3 耐药性检测 耐药性分子基础： 利福平是抗结核治疗的关键药物。耐药的分子基础是RNA聚合酶的突变，主要集中在rpoB基因的81bp区域。 耐药性鉴定： PCR-SSCP法和点突变的检测法 金黄色葡萄球菌 幽门螺杆菌 O157型大肠埃希菌 淋病奈瑟菌 标本的预处理 核酸的提取(DNA提取、 RNA提取) 扩增抑制物的去除 危险病原体的灭活 四、感染性疾病分子诊断的结果解释 解释应包括病原体的生物学、病理学特征、实验技术的优点及局限性。 阴性结果 阳性结果 定性检测结果 疾病状况的判断 阴性结果解释 检查质控是否正常。 检查检测灵敏度、核酸提取量及扩增效率是否正常。 引起假阴性的因素：样品量不足、标本类型不恰当、收集时间不符合要求、运输过程中样本降解。 阳性结果解释 检测质控是否正常。 注意检测的特异性和可能受到的污染等情况。 产生假阳性的因素：引物探针的特异性、样本在采集、运送和处理等不同环节中的交叉污染问题。 定性检测结果解释 考虑定性检测的局限性 考虑特定情况下，核酸样本的稳定性和不易降解性。 疾病状况的判断 病原体存在与患病之间的相关关系 为正确判断疾病应：选择具有代表性的标本，采用具有说服力的检测方法，建立适量的临界值。 五、感染性疾病分子诊断的临床应用及评价 弥补血清学检测技术的缺陷 检测不能培养或生长缓慢的病原微生物 通过病原体的定量检测监测疾病 微生物耐药性的检测 细菌分型及流行病学的调查 Section 2 病毒的基因检测 SARS相关冠状病毒的分子诊断 2003年4月，香港研究者Peiris等报告了50 例SARS病人的临床表现和病毒学研究结果。 一种新的冠状病毒 (Coronavirus) 是SARS 的致病原因。 (Lancet, 2003, 361: 9365) 2003年4月，德国汉堡Bernhard-Nocht热带医学研究所学者Drosten等用随机扩增技术，获得一段长度为300bp的核苷酸序列。 根据这段序列，建立了检测新冠状病毒的常规和实时定量PCR技术。 ( on April 10, 2003） 检测标本 痰液、咽拭子、鼻拭子、支气管肺泡灌洗液 、血浆、粪便。 检测方法 1. 逆转录-巢式PCR (Reverse-Nested PCR) 2. 逆转录-实时PCR (Reverse-Real time PCR) 有报道显示，在可能SARS病人中病毒的检出率为100%。 在疑似SARS病人中的检出率为23%。 所有健康接触者中未检测到病毒。 另一项研究显示 检测病毒的3种方法（血清学检测、病毒分离、PCR技术）中，PCR技术的检出率最高。 讨论 疾病的早期即可获得阳性结果(早于血清转换期）。 SARS患者中的阳性率约为80%，对照中的阴性率约为98%～100%。 现有的PCR方法有较高的特异性但灵敏度较差，阴性结果不能排除病毒感染。 痰液中病毒RNA浓度极高，说明病毒从呼吸道排放是主要传播途径。 血清中检测到极低浓度的病毒RNA，提示病毒复制不仅发生于呼吸道。 病人恢复晚期的粪便中存在病毒RNA，说明粪便可能也是一种传播途径。 鼻、咽子中含有的病毒RNA显著少于痰液，提示不适合作为标本（有可能漏检）。 SARS相关冠状病毒基因检测必须注意的问题 必须在规范的基因扩增实验室中进行。 应采取必要的质控规程，包括阳性对照和阴性对照。 阳性结果时必须对原始样本重复检验： 或者扩增另一个基因片段 或在另一个实验室对同一样本进行检测。 肝炎病毒基因的检测(hepatitis B virus, HBV) 乙肝病毒基因组中有4个ORF，分别称为S、C、P和X。S区编码HBV的包膜蛋白，C区编码