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医学遗传学设计实验 实验设计方案： 6．参考文献 一、实验名称 ： 二、总体设计思路： 三、具体设计方案： 1．实验目的 2．实验原理 3．实验材料、试剂及器材 4．实验方法及注意事项 5．实验预期结果及遗传指导 一、实验名称 ： 从孕妇外周血中提取胎儿 DNA进行a地贫的产前诊断 二、总体设计思路： 抽取孕妇外周血 → 提取胎儿DNA → 利用 PCR技术进行胎儿DNA扩增 → 利用Sou-thern分子印迹杂交法检测出限制性片段长 度多态性（RFLP）进行基因诊断【用DNA限制酶处理扩增产物 → 琼脂糖凝胶电泳 → 转膜 →探针标记 → 预杂交 → Southern杂交 → 洗膜 → 放射性自显影检测】 三、具体设计方案： 1．实验目的 利用孕妇外周血中游离的胎儿DNA进行a地贫的产前诊断，从而进行遗传指导。 2．实验原理： 地中海贫血的分布遍及全世界，我国南方省区的发病率也较高，如广西壮族自治区可高达14.6%，其次为广东、海南、云南等。在遗传咨询的基础上，对高风险的胎儿进行产前诊断和选择性终止妊娠是防止遗传病、先天畸形患儿出生的最有效而可行的方法，对于减少群体中致病基因频率和提高人口素质具有十分重要的意义。 传统产前诊断方法一般采用羊膜腔穿刺、绒毛膜取样和脐静脉穿刺等，它们都具有创伤性，可能对孕妇及胎儿造成一定危害，如宫内感染、出血甚至流产、死胎等。利用孕妇外周血中游离的胎儿DNA进行产前诊断是一项非创伤性产前诊断技术，易于被孕妇接受。 孕妇外周血中游离的胎儿DNA含量相对高，提取及分析过程简单，易于发展为可应用于临床的大样本高通量的检测方法。另外胎儿DNA在孕早期就可检测到，且分娩后很快被清除，不会受前次妊娠的影响。 PCR技术能在体外快速简便地扩增特异的DNA片段，为基因诊断分析提供了方便，被广泛运用于遗传病和肿瘤的基因诊断。若PCR产物的片段中包含有RFLP的切点，则可将PCR扩增产物用相应的限制酶处理，经电泳后检测其多态性，结合系谱进行分析，可进行基因诊断。 Southern分子印迹杂交是将酶解后的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离，然后经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过吸附作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，附着在滤膜上的DNA与32p标记的探针杂交，利用放射自显影技术确定探针互补的每条DNA带的位置，从而可以确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。此法可检测出限制性片段长度多态性（RFLP），从而进行基因诊断。 3．实验材料、试剂及器材 3.1 材料： 孕妇的新鲜外周血5 ml、琼脂糖凝 胶（新制备）、硝酸纤维素滤膜（NC膜）、透明胶带、防护眼镜、塑料瓶、塑料袋、保鲜膜、滤纸、X光底片 3.2 试剂： EDTA（乙二胺四乙酸）盐抗凝剂，0．12 ml 10% 的中性buffer溶液(含4 %的甲醛)，QIAamp DNA提取试剂盒(Qiagen)；Taq酶(Takara)，双蒸水， PCR缓冲液， dNTP (Promega)， AmpF1STR@扩增试剂盒(ABI)；BamHI内切酶，DNA上样缓冲液，放射性物质（32p），变性液，预杂交液，2×SSC（50%甲酰胺），X光片冲洗液。 3.3 主要仪器： 离心机，冰箱，基因扩增仪、微量移液枪(20μl)，电泳仪，紫外透射仪，封口器，southern印迹杂交实验仪器，水浴锅（0℃，42℃，100℃），琼脂糖平板电泳装置，放射性检测仪，暗盒（加双侧增感屏） 4．实验方法及注意事项 4.1 方法步骤： 4.1.1 血浆制备： 抽取孕妇外周血5 ml，加入EDTA抗凝剂，0．12 ml 10% 的中性buffer溶液(含4 %的甲醛)进行预处理。 4.1.2 提取胎儿游离DNA： （1）离心 第一次离心：经预处理后的血浆以1600×g的速度 离心10min，离心后取上清液置一20℃保存备用； 第二次离心：将第一次离心后的上清液以13000—16000×g的速度高速离心10min，离心后取上清液置一20℃保存备用。 （2）提取胎儿游离DNA： 取出上清液按照血样DNA提取试剂盒(QIAamp DNAbloodmini, Qia2gen)说明书中血液DNA的提取方案提取DNA。 4.1.3 利用PCR技术进行胎儿DNA扩增: 采用15 bp的随机引物，反应体系为： l0×PCR缓冲液5μl ，Taq酶5 U，25 mmol／L MgC12 5 μl ，2.5 mmol／L dNTP 4μl ， 200 mmol／L 15 bp随机引物5 μl ，加双蒸水至50 μl ，置于基因扩增仪上。反应条件为94℃预变性4 mi