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引物设计 　　　之浅谈 PCR过程 内容 引物设计的原则 Primer premier 5.0的使用 植物表达载体引物设计 原核表达载体引物设计 酵母表达载体引物设计 一、引物设计的原则 引物长度 一般为15-30个核苷酸. 在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。 同一碱基连续出现不应超过5个 GC含量一般40-60% GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性 GC含量太高也易于引发非特异扩增。 碱基分布的均衡性 引物Tm值 一般要求：55℃-65℃。 计算： 对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算 对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。 Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15　　 引物二级结构 引物二聚体 尽可能避免两个引物分子之间3’端有较多碱基互补 发夹结构 尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。 引物3’端 引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。 3’端的末位碱基会导致不同的错配机率． 引物5’端 引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列。 5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5’端加上适当数量的保护碱基）。 5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。 5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。 总结 1、长度为15-30bp 2、避免有聚嘌呤或聚嘧啶，尤其是３‘端 3、Tm值：55-65℃ 4、避免二级结构 5、3‘端末位为TG（C）A 二、引物设计软件 Primer Premier 5.0 生物软件网购买 下载，安装后，用文本编辑器打开WIN.INI，将vspace=DU改为vspace=PU，并将其改成只读，便可以使用全部功能。 三、植物表达载体构建引物设计 设计引物步骤 1、对基因进行酶切位点分析 2、选择适当的表达载体及酶切位点 3、根据上、下游序列设计引物 举例 lipid transfer protein ATGGCAGGCTCTTCCGCCCTGTTCAAGCTCGCTTGCTTAGTTGCCGCGTTCATGATTGTATCTGCGCCACATGCAGAAGCTGCCATATCATGCGGTACCGTCGTCTCAAAGCTCGCCCCATGCCTCGGCTTTCTCAGGGGCGGCGGTTCCCCACCACCTGCTTGTTGTAGTGGGATTAGAAACCTTCAAAGCATGGCTAGGAGTACACCCGATCGTCAAGCTGCTTGCGGGTGCTTGAAGTCTGCTTCGGCTGGTGTTAATATGCGTAATGCTGCCGCTCTTCCCGGTAAATGTGGTGTGAACATCGGTTACCCAATCAGCAGGAGCGTTGACTGCTCCAGGGTGAAGTGA Enzymes that do not cut: ApaLI, ApoI, AscI, AseI, AsiSI, AvaI, AvaII, AvrII, BamHI, BanII, BbeI, BbsI,BbvCI, BceAI, BcgI, BcgI, BciVI, BclI, BfrBI, BglI, BglII, BlpI, Bme1580I, BmrI, BmtI, BplI, BpmI, Bpu10I, BpuEI, BsaI, BsaAI, BsaBI, BsaHI, BsaWI, BsaXI, BseRI, BseYI, BsgI, BsiHKAI, BsiWI, BsmI, BsmFI, Bsp1286I, BspEI, EcoICRI, Eco57MI, EcoNI, EcoO109I, EcoRI, EcoRV, FalI, FokI, FseI, FspI, FspAI,HaeII, HaeIII, HgaI, Hin4I, Hin4I, HincII, HindIII, HinfI, HpaI, HpaII, HphI,Hpy188I, HpyCH4IV, KasI, MaeIII, MfeI, MluI, MlyI, MmeI, MscI, MseI, MslI, NaeI, NarI, NciI, NcoI, NdeI, NgoMIV, NheI,