实验三_质粒DNA的提取与酶切课件.ppt

实验安排 上午： 质粒DNA提取 限制性内切酶酶切鉴定 琼脂糖凝胶制备 下午： 酶切产物的电泳 紫外分光光度法检测DNA 实验课题设计的要求与安排 1 实验步骤： 加1.5ml培养物于EP管，12000rpm×30s ? 去上清（除净），加入150μl 溶液I，充分重悬 ? 加入200μl 溶液II，立即、轻柔振荡数次 ? 加入150μl 冰溶液III，震荡10s，冰浴3~5min， 12000rpm×10min 转移上清到新EP管，加入1/2体积酚加入1/2体积的氯仿：异戊醇 （共约450μl）（酚/氯仿/异戊醇 ----25/24/1） 振荡混匀，离心12000rpm×5min 转移上清到新EP管， 加入等体积氯仿：异戊醇（共约450μl） 振荡混匀，离心12000rpm×5min 转移上清到新EP管加入2倍体积95%乙醇（约800μl）混匀，静置5分钟以上 离心12000rpm×15min 弃上清， 100 μl 75%乙醇洗沉淀，12000rpm×2min? 弃上清，静置干燥，0.1×TE 20 μl 溶解DNA 酶切鉴定（16 μl） 分离纯化质粒DNA 的三个主要步骤： ①培养细菌使质粒扩增 ②细菌的收集与裂解 ③质粒DNA的纯化  所有纯化方法都是利用了质粒DNA分子相对较小及共价闭合环状的性质。 碱法抽提质粒的主要试剂的作用原理 溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris?Cl组成. 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏质粒。 EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用。 Tris?Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围。 溶液Ⅱ：SDS、NaOH SDS的作用：解聚核蛋白、并与蛋白质结合使之变性； NaOH的作用：破碎细胞，使DNA分子变性。 质粒的三种构型： 闭合环状DNA 开环DNA——如果两条链中有一条发生一处或多处断裂，分子因旋转而消除链的张力。 线状DNA——如果两条链均断开，即为 线状DNA。 3 注意点： 提取的DNA不纯，含有其它杂质（蛋白、多糖） 变性不充分； 关键过程反应时间过短； 离心时间或速度不够。 提取的DNA成涂布状： 操作过程中用力过猛，动作粗暴； 操作系统有污染。 混有染色体DNA： 变性过程不完全， 试剂配置有问题。 第二部分：酶切鉴定（双酶切） 反应体系（20μl） 分3大组，每组约10-12人 每大组配置一份“母液” 混匀“母液”，分装（4 μl/人） 每人将酶切底物（质粒）与反应体系（分装的“母液”）混合 充分混匀，瞬时离心 37?C，1-3小时 电泳检测 基因克隆示意图 基因工程诞生的技术突破 限制性内切酶（restriction enzymes） 1970年H. O. Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶。 限制性核酸内切酶 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶 来源：原核生物 功能：自我保护——细菌的限制和修饰系统（R/M体系） pUC119物理图谱 质粒酶切电泳结果分析与小结： 第三部分紫外分光光度计检测DNA 特点 灵敏度高：测定下限可达10－5～10－6 mol/L, 准确度能够满足微量组分的测定要求： 相对误差2～5％ 操作简便快速 应用广泛 光学光谱区 （真空紫） 远红外 中红外 近红外 可见 近紫外 远紫外 10nm~200nm 200nm ~380nm 380nm ~ 780nm 780 nm ~ 2.5 ?m 2.5 ?m ~ 50 ?m 50 ?m ~300 ?m 氢灯 复合光 （阳光及钨灯） 发射光谱 红 橙 黄 绿 青 蓝 紫 单色光 三棱镜 可见光分光光度计光源 紫外分光光度计光源 光学原理 吸收光谱 在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液， 光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收 而消失，这种被溶液吸收后的光谱称为该 溶液的吸收光谱。 苯和甲苯在环己烷中的吸收光谱 苯(254nm) 甲苯(262nm) A ? 230 250 270 Lambert-Beer定律 A或D＝K C L 吸光度 摩尔消光系数 吸收物质的光径（cm）